酪氨酸酶的提取及其催化活性研究（课件）

酪氨酸酶的提取及其催化活性研究 n 目的进一步研究影响酪氨酸催化活性的因素, 减少黑色 素在生物体内的生成。 n方法以pH值7. 2的Na2HPO4-HCl缓冲溶液为体系, 用分光 光度计在480 nm 处测定马铃薯提取液的吸光度, 以吸光 度对时间的变化率(A / t) 为反应速率, 建立多巴溶液的转 换动力学曲线, 从而可计算出酪氨酸酶的活性。 n结果结果显示, 在480 nm波长下, 以pH 值7. 2 Na2HPO4 -HC l缓冲溶液为体系, 对测定体系干扰小, 所测数据波动 小, 酪氨酸酶的活性稳定性高, 为进一步确定和研究影响酪 氨酸酶活性的因素提供了理论依据。 n结论试验以缓冲溶液为底物研究和测定酪氨酸酶的催化 活性, 准确度高, 效果佳。 酪氨酸酶 n是一种多酚氧化酶, 具有广泛用途。它主要 存在于动植物体中, 在它的催化作用下经过 一系列的生化反应生成色素。反应式如下: n以N a2HPO4-HCl缓冲液为体系, 采用分光光 度法测定马铃薯中酪氨酸酶的活性, 为食品 工业加工水果、蔬菜防褐变过程提供参考。 1 材料与方法 n1. 1 试验原理 可用比色法测定酪氨酸酶, 其活性 计算可采用下式: a= k /( 10- 6 V 2. 5 0. 1) n式中, a 为所用马铃薯溶液的酶的活性, k为多巴红 的摩尔 n吸收系数(即动力学曲线斜率) , V 为加入的酶体积 。从而可用: A = aV0 /m 计算出所用原料中的酶 的活性, 其中, A 为原料中酶的活性, V0 为原料所 得的酶溶液的总体积, m 为原料总质量。 n1. 2 材料 供试原料为市售马铃薯。仪器: V IS 7220 型可见分光光度计(北京瑞利分析 仪器公司); 电热恒温水浴锅( 天津市中环试 验电炉有限公司); 离心机; 秒表。药品: n0. 01 mol/L 二羟基苯丙胺酸( 多巴) 溶液, 0. 10 mol/L nN a2HPO4 缓冲溶液( pH 值7. 2和pH 值6. 0) , 盐酸。 1. 3 方法 n1. 3. 1 酪氨酸酶的提取 3。在研钵中放入10. 0 g切碎的 马铃薯, 加入7. 5m l pH值7. 2的缓冲溶液, 研磨挤压。滤 出提取液, 离心分离。倾出上层清液保存于冰浴或冰箱中 。 n1. 3. 2 酶的活性测定。取6. 0 m l上述提取液, 用pH 值 7. 2的缓冲溶液于10. 0 m l比色管中稀释至刻度, 摇匀。取 0. 1 m l稀释过的提取液于10. 0 m l比色管中, 加入2. 9 m l pH 值6. 0的缓冲溶液, 再加入2. 0 m l多巴溶液, 用分光光 度计在480 nm处测定吸光度。开始6m in内每分钟读1个 数, 以后隔2m in读1个数, 直至吸光度变化不大为止, 得吸 光度为A1。取0. 2, 0. 3, 0. 4 m l已稀释过的提取液重复上 述试验, 得吸光度分别为A2、A3、A4。 2 结果与分析 n2. 1 酶的动力学曲线的建立 以表1中的吸光度为纵坐标, 时间为横坐标, 可得出在加入酶的作用下, 多巴溶液的转换 动力学曲线, 再由曲线的直线部分得出直线 斜率(即转换速率), 由斜率可求出酶的活性 。 22 酶的活性计算 n根据公式 n(其中k是斜率, 由图1可知), 将不同的k、V 值代入公式, 可求得提取液中酪氨酸酶的活 性, 由公式A = a V0 /m(其中V0 = 6. 0 ml 、m = 10. 0 g, 即马铃薯原料的总体积和质 量)可得原料马铃薯中酪氨酸酶的活性。 表1 不同体积提取液在不同时间下所 测的吸光度 表2 不同体积提取液得出的原料中 酶的活性数据 3 结论 n试验采用分光光度法测定了马铃薯系列提 取液在不同时间段的吸光度, 通过吸光度建 立酪氨酸酶的动力学曲线,可得斜率; 由斜 率可得出马铃薯提取液及原料中酪氨酸酶 的活性, 为进一步研究影响酪氨酸酶的活性 提供理论依据。 n酪氨酸酶 n是一种含铜酶，来源于胚胎神经峭细胞，是黑色 素代谢和儿茶酚胺的关键酶，并且是白癜风自身 免疫的重要抗原。最近发现部分白癜风患者血清 中有酪氨酸酶抗体，且与白癜风临床类型和分期 密切相关。提示自身免疫性白癜风发病机制与酪 氨酸酶抗体水平有关，为其免疫治疗提供依据， 酪氨酸酶抗体可以作为白癜风活动性的一个指标 。 酪氨酸酶其实是一种铜结合蛋白，所含的离子 铜特异性能与人酪氨酸酶结合，一个位点的铜结 合可以促进另一个位点的铜结合，组氨酸在铜B位 点协调其结