偏头痛风湿夹瘀证动物模型的建立(返修)

偏头痛风湿夹瘀证动物模型的建立与评价罗钢1 陈辉2 古远云1白雪1 杨思进1（1泸州医学院附属中医医院心脑病科2泸州医学院附属中医医院综合老年病科，646000）摘要：目的：尝试建立并评价偏头痛风湿夹瘀证动物模型。方法：使用人工气候箱风湿刺激加利血平化低5-HT伴局部脑血管痉挛协同诱导建立大鼠偏头痛风湿夹瘀证动物模型，通过观察动物一般生命体征（活动、体重、眼眵、毛发、进食、大便），挠头次数，图像采集、分析技术研究模型大鼠风湿夹瘀证生物表征（舌象RGB）的变化及动物凝血、五羟色胺等，观察模型动物是否符合风湿夹瘀症候特征。结果：利血平组与利血平加风湿造模组大鼠较对照组凝血时间明显缩短，痛阈降低，全血及脑内5-HT含量明显下降（P 0.01），利血平加风湿造模组大鼠眼眵增多，活动减少，进食减少，大便稀溏，舌象RGB值分析，对照组大鼠舌象淡红，利血平组舌象紫暗，利血平加风湿组舌质青灰，3组舌象RGB值有明显差异。结论：使用人工气候箱风湿刺激加利血平化低5-HT伴局部脑血管痉挛协同诱导可建立大鼠偏头痛风湿夹瘀证动物模型，但仍需进一步改进造模评价方法与流程。关键词：风湿夹瘀证 偏头痛 利血平 证候模型中图分类号：Q95-34 R255 文献标识码：A 文章编号：Establishment of migraine with blood stasis syndrome animal model of rheumatismChen Hui1，Luo Gang2，Bai xue1 Yang sijing1Yuanyun-Gu1（1 Geriatrics 2Department of Cardiology，The Second Affiliated Hospital of Luzhou Medical College） Abstract：There is evidence to suggest that migraine rheumatism stasis syndrome is obviously much more than other syndromes. We have therefore tried to establish rat migraine rheumatism stasis syndrome animal model with artificial climate chest rheumatism stimulation ,low 5-HT caused by reserpine combined with local cerebral vasospasm.Reserpine plus rheumatism rat model was significantly shorter in blood coagulation time,pain threshold, 5-HT content in blood and brain compared with control groups. Significant differences of tongue RGB value can also be found in groups.All indexes proved that rat migraine rheumatism stasis syndrome animal model was successful. Therefore, this model provides a platform for exploration migraine with the characteristics of traditional Chinese medicine.Objective ：Try to establish and evaluate a migraine rheumatism stasis syndrome animal model. Method：The use of artificial climate chest rheumatism stimulation with reserpine low 5-HT with local cerebral vasospasm induced by combination of establishment of rat migraine rheumatism stasis syndrome animal model, through the observation of animal life signs (activity, weight, gum, hair, eating, stool), image acquisition, analysis of rheumatic technology research model rats with blood stasis syndrome biological characterization (tongue RGB) changes and animal blood coagulation, five hydroxytryptamine. Result ：Reserpine group and reserpine plus rheumatism rat model was significantly shorter than that in the control group, blood coagulation time reduced pain threshold, 5-HT content in blood and brain decreased significantly (P 0.01), reserpine plus rheumatism rat model gum increased, decreased activity, reduced food intake, loose stool, tongue image analysis of RGB value, the rats of control group tongue pale red, reserpine group tongue dark purple tongue, reserpine plus rheumatism group steel, 3 groups of tongue RGB value have obvious difference. Conclusion：The use of artificial climate chest rheumatism stimulation with reserpine low 5-HT with local cerebral vasospasm induced by combination can establish rat migraine rheumatism stasis syndrome animal model, but it still needs further improvement of molding the evaluation method and process.Key words：Rheumatism stasis syndrome，Migraine，Reserpine，Syndrome model 偏头痛（Migraine）又称为血管性头痛，以间歇性头痛发作伴自发性功能紊乱为特征1。临床常见多发，本病反复发作，迁延难愈，严重影响患者的身心健康、生活及工作，给家庭及社会带来严重的经济负担。现代医学认为主要发病机制有：血管源学说，皮层扩散性抑制(CSD)学说，三叉神经-血管源学说。现代中医药研究认为2偏头痛的共同病因病机以风、瘀、湿、虚为主，张冰锐等认为偏头痛证型中以风痰瘀症为主3,我们推断偏头痛临床证型以风湿夹瘀证型最多。本实验尝试使用人工气候箱风湿刺激加利血平化低5-HT伴局部脑血管痉挛协同诱导建立大鼠偏头痛风湿夹瘀证动物模型，试图开发搭建真正符合中医药作用特点的偏头痛中药新药评价体系和评价平台。1 材料与方法1.1 动物与分组 清洁级成年SD大鼠30只，雌雄各半，体重200-250g，由泸州医学院动物实验中心提供。实验动物使用生产许可证号：SYXK(川)20082013-06517。动物质量合格证：医动字24101129，适应性饲养3天后随机分为对照组（n =10）、利血平组（n =10）、风湿加利血平组（n =10）3组，每组各10 只。动物饲养的室内温度21-27，相对湿度45%-55%。各组大鼠喂常规饲料，自由进食饮水。1.2 主要实验药品 利血平针：天津金耀氨基酸有限公司，上海复旦复华药业有限公司，国药准字H12020905030108。2%戊巴比妥钠，由泸州医学院神经生理学教研室提供粉剂，并于实验前配制。1.3 主要仪器 脑立体定位仪;佳能5DIII高清晰照相机；索尼HDR-PJ760E高清摄像机，SHH-250GS人工气候箱，上海思龙科学仪器有限公司；Image J 1.36b图像分析软件。1.4 模型制备 各分组动物适应性饲养3天后，对照组，按10mg/kg背部皮下注射生理盐水，连续14天；利血平组皮下注射利血平10 mg/kg/天,于第14天将小鼠乙醚麻醉,并脑室注射血凝块2g；风湿加利血平组：将本组大鼠置于人工气候箱中喂养，设定温度15-20，相对湿度90%-95%，每天强制高强度送风对流2小时，皮下注射利血平10 mg/kg/天,于第14天将大鼠乙醚麻醉,并脑室注射大鼠血凝块2g造模。1.5 观察指标（1）动物喂养14日内的一般情况，包括活动情况、皮毛色泽、进食、大便性状。（2）观察第15日皮下注射生理盐水或利血平及血凝块后各组大鼠行为改变，并计大鼠搔头次数。（3）皮下注射生理盐水或利血平及血凝块后4h后各组麻醉下进行舌象、耳廓、眼结膜图像采集。（4）大鼠凝血及脑组织5-HT含量测定：舌像及图像采集2小时后，经颈静脉采血后测定凝血指标，将动物迅速断头、取脑，放入预先冰冷的生理盐水中，除去脑膜和血管，称重；再放入预先冰冷的玻璃匀浆器中，少于0.5g脑组织加盐酸(0.01mol/L）0.4ml和正丁醇5ml，匀浆12min，充分振荡。倾出匀浆液至离心管中，1500r/min离心10min。吸取正丁醇上层液2ml，加入到含有2ml石油醚和2.5ml盐酸（0.1mol/L） 的具塞离心管中，振荡5min。5-HT被提抽至盐酸溶液中，离心（3000r/min，10min），分开有机相和水相，吸取下层水相0.5ml，加入含有0.25% L-cys 0.1ml和0.004%OPT3ml试管中，置于电热恒温水浴锅中，煮沸10min。迅速冷却，用荧光分光光度计于Ex365nm、Em470nm波长处测定，以ng/g脑重表述。1.6 舌象图像采集各组在皮下注射生理盐水或利血平及血凝块后4h后给予2%戊巴比妥钠60mg/kg腹腔麻醉，将照相机固定在体视显微镜架上，将体视显微镜光源调到最大。麻醉大鼠置于镜架下固定位置，用无齿镊夹住舌尖位置，平行于桌面轻拉出舌，进行照相，照相机置于手动模式，光圈8.0，快门1/100s，以体视镜架焦距螺旋调焦。1.7 舌像RGB分析用photoshop图片处理软件将大鼠舌象照片裁剪成980x490 px大小图片，分别设置10条水平与垂直参考线，随机选取6个x与y坐标交点记录该点红色、绿色、蓝色成分数值。1.8 统计学处理应用SPSS15.0统计学软件进行数据处理，所有数据均用均数标准差（）表示，对数据进行正态分布检验和方差齐性检验，若两项检验均符合，使用单因素方差分析（One-wayANOVA）统计，组间比较采用SNK检验，对不满足任一检验的数据，采用非参数检验中的多个独立样本Kruskal-Wallis H检验，组间比较采用MannWhitneyU法检验，均以P0.05作为差异有统计学意义的界限。2 结果2.1 大鼠一般情况观察对照组大鼠在饲养期间均毛发光洁整齐，食欲可，行动灵活敏捷。利血平组及利血平加风湿组出现精神不振，眼睛眯成线状，体温明显下降，蜷缩少动情况。利血平加风湿组出现眼眵增多，进食减少现象。实验开始理前观察各组大鼠大便，多为软便、中等质地或偏硬质润，利血平组肛门口有粪便堆积，利血平加风湿组以软便及润便为主，部分出现稀溏便。2.2 复制偏头痛实验动物模型后行为变化2.2.1 一般改变利血平组及利血平加风湿组造模后，模型动物精神不振，眼睛眯成线状，体温明显下降，蜷缩少动，四肢震颤，类似寒战，前肢紧贴口鼻，前肢腕关节弯曲，贴近躯干，头缩向躯干，肛门口有粪便堆积，部分大鼠腹下部湿漉，体重逐日下降，毛发无光,与相关文献34描述相符。2.2.2 造模后大鼠搔头次数计数以前肢搔脸1 次计1 次，后肢快速搔头动作从开始到停止计1次，人工观察计算每只大鼠皮下注射后至2h的搔头次数。结果（表1）：对照组（12.134.66）次，利血平组（68.256.8）次，利血平加风湿组（73.255.04）次。统计后发现利血平组、利血平加风湿组大鼠搔头次数高于对照组，且均有统计学意义,差异有统计学意义（P 0.01）。利血平组、利血平加风湿组对比组间无统计学差异。2.3 各组大鼠造模后凝血及5-HT的变化由表1可见利血平组与利血平加风湿组所致大鼠盘头痛模型凝血时间较对照组均有不同程度缩短，差异有统计学意义（P 0.01），两组间无明显差异。由表1可见利血平组与利血平加风湿组所致大鼠盘头痛模型5-HT较对照组均有明显降低，差异有统计学意义（P 0.01）两组间无明显差异。表1 各组大鼠造模后2h 内搔头次数、凝血时间及5-HT结果（n =10，）组别动物只数（只）挠头次数凝血时间（s）5-HT（ug/ml）对照组1012.334.6683.1521.17535.15121.27利血平组1068.256.81）51.2613.351）91.3623.451）利血平加风湿组1073.255.041）49.3512.371）87.2331.221）注：与对照组比较：1）P 0.01表1 各组2h 内搔头次数（n =10，）组别挠头次数对照组12.334.66利血平组68.256.8#利血平加风湿组73.255.04#注：与对照组比较：#P 0.012.2.34 大鼠舌象RGB值比较肉眼观察对照组大鼠舌质淡红，利血平组颜色偏紫暗，利血平加风湿组舌质偏青灰，组间细微差异肉眼无法进行分辨。通过图片分析软件对其色差进行统计分析发现（表2）利血平组与利血平加风湿组大鼠的舌象与对照组大鼠的舌象在红色成分上有均有差异(P005)，二者间无明显差异，利血平组大鼠与对照组大鼠的蓝色成分差别显著(P001) ，利血平加风湿组大鼠与对照组大鼠的绿色成分差别显著(P001)。而利血平加风湿组大鼠绿色成分高于利血平组，蓝色成分低于利血平组(P005)。表2 各组大鼠舌象RGB值分析结果（n =10，）组别红色绿色蓝色对照组1133.2183.152.1788.3510.73利血平组1475.43#1）1126.451）#2195.352）#利血平加风湿组1434.351）#1883.37#2）3）1437.352）#3）注：与对照组比较#1）P 0.05，#2）P 0.01 与利血平组比较3）P 0.052.3 各组大鼠造模后凝血及5-HT的变化2.3.1各组大鼠造模后凝血时间的变化由表3可见利血平组与利血平加风湿组所致大鼠盘头痛模型凝血时间较对照组均有不同程度缩短，两组间无明显差异。表3 各组模型大鼠凝血时间结果（n =10，）组别动物只数（只）凝血时间（s）对照组1083.1521.17利血平组1051.2613.35#利血平加风湿组1049.3512.37#注：与对照组比较：#P 0.012.3.2各组大鼠造模后血清5-HT的变化 由表4可见利血平组与利血平加风湿组所致大鼠盘头痛模型5-HT较对照组均有明显降低，两组间无明显差异。表4 各组模型大鼠凝血时间结果（n =10，）组别动物只数（只）5-HT（ug/ml）对照组10535.15121.27利血平组1091.3623.45#利血平加风湿组1087.2331.22#注：与对照组比较：#P 0.013 讨论 中医学最鲜明的特点是辨证论治，强调疾病的动态变化。中医的“证”指疾病发生和演变过程中某阶段以及患者个体当时所处特定内、外环境本质的反映，它以相应的症、舌、脉、形、色、神表现出来，能够不同程度地揭示病因、病位、病性、邪正盛衰、病势等病机内容，是辨证论治的起点和核心。动物模型是研究与认识人类疾病的重要途径，在中医理论指导下制备符合中医证候特点的动物模型是促进中医药现代化的关键，病证结合便是中西医结合研究的重要环节45，中医证型动物模型可在中药新药开发中发挥重要作用，帮助搭建真正符合中医药作用特点的评价体系和评价平台，推进我国自主创新中药的发展。而目前公认的思路是采取中医病因因素结合西医病理因素造模，并力求在动物的生物表征，如舌象、唇象、爪象、耳轮、尾尖、眼球、毛皮及动物行为等表现上模拟人的表征，并采用方药反证法加以验证，即遵循因-脉-证-治的思路56。 5-羟色胺( 5-HT) 在偏头痛的发病过程中起着很重要的作用7-8，利血平化低5-HT 偏头痛小鼠模型是国内外比较常用的偏头痛动物模型，与人类偏头痛发作时低5-HT状态类似。本实验两组模型组造模后小鼠凝血时间明显缩短，痛阈降低，全血及脑内5-HT含量明显下降，这表现基本反映了偏头痛的特点。说明模型组从病理生理学角度上是成功的。中医通过望、闻、问、切四诊分析疾病，一般认为动物与小儿一样，同为哑科，以观为主，所以在建立模型时参考并移用中兽医的诊断技术，尽可能对大鼠的呼吸、闻叫、体温、大小便、皮毛、舌象进行观察。本实验利血平组大鼠皮下注射后出现挠头、精神不振，眼睛眯成线状，体温明显下降，蜷缩少动等现象，符合有关文献69描述利血平化致5HT 偏头痛模型小鼠具有阳虚、脾虚、血瘀证的证候属性。而利血平加风湿组出现眼眵增多，活动减少，进食减少，大便稀溏等类似风湿证候特性。舌诊是观察患者舌质和舌苔的变化以诊察疾病的方法，是望诊的重要内容。临床实践证明。在疾病的发展过程中，舌的变化迅速而又鲜明，凡脏腑的虚实、气血的盛衰、津液的盈亏、病情的浅深、预后的好坏，都能较为客观地从舌象上反映出来710。肉眼观察舌像难免照成偏差误差，主观性大，不利于分析研究，本实验通过计算机对舌象RGB值分析，可尽可能减少人为误差。本实验发现风湿加利血平组大鼠模拟风湿夹瘀证型的舌象偏青灰色，与空白组大鼠的舌象比较在红色、绿色、蓝色成分有差异，而绿色、蓝色成分差异更加显著，有文献研究报道舌象与症候之间关系811，风和灰苔、淡白舌有联系，痰和暗舌、青舌、紫舌、舌下络脉青紫有联系;血瘀和青舌、舌生瘀斑、舌下络脉青紫有联系，而本实验结果与其报道相符合。本实验尝试使用人工气候箱风湿刺激加利血平化低5-HT伴局部脑血管痉挛协同诱导建立大鼠偏头痛风湿夹瘀证动物模型，通过观察动物一般生命体征（活动、体重、眼眵、毛发、进食、大便），图像采集、分析技术研究模型大鼠风湿夹瘀证生物表征（舌象RGB）的变化及动物凝血、五羟色胺等变化。发现实验动物较符合风湿夹瘀偏头痛证型，符合中西医结合病证结合动物模型，但本实验尚缺乏对风湿瘀血的客观评分，下一步计划建立风湿夹瘀动物模型评分系统，则使该造模方法更具有说服力，并使用针对风湿夹瘀证候的中药、成药进行治疗反证。参考文献1 Headache Classification Committee of t