基因重组与基因工程课件

1 第十四章 基因重组与基因工程 2 基因重组：genomic recombination 重组DNA：recombinant DNA 3 第一节、自然界的基因重组 转化：transformation 整合：integration 转导：transduction 转位：transposition 4 转化 转化： 由外来 DNA引 起生物 类型改 变的过 程称为 转化。 细菌的转化 5 转化 病毒癌基因 感染宿主细 胞后，可整 合到宿主染 色体上，从 而使宿主细 胞癌变。 转染：噬菌体感染宿主菌后，核酸进入菌体 内的过程。 细胞的转化 6 整合 整合： 噬菌体感染大肠杆菌的第一步 噬菌体粘附于细胞壁上，将自身的 DNA注入菌体中。 此 DNA可与细菌染 色体重组，成为细菌染色体的一部分。 溶原菌：整合了噬菌体基因组的细菌。 裂解： 噬菌体感染大肠杆菌的第二步 DNA利用菌体的酶系统，复制自身及 外壳蛋白，组装成大量新 噬菌体，并将 细菌涨破。 7 整合 溶原 和裂 解可 以相 互转 变。 8 转导 溶原菌中 DNA可以原样地切离出来， 也可以把邻近的宿主DNA在切离时带走 一部分。后者称转导。 带有宿主DNA的噬菌体称转导噬菌体。 来源于宿主的基因称转导基因。 9 转位 转位：一个或一组基因从一处转到基因 组的另一个位置。 这些游动的基因称为转位子(transposon) 。 10 转位 11 第二节、基因工程 基因工程：是用分离纯化或人工合成的 DNA在体外与载体DNA结合，成为重组 DNA，用以转化宿主，筛选出能表达重 组DNA的活细胞，加以纯化、传代、扩 增，成为克隆。也叫基因克隆或重组 DNA技术。 分子水平上操作，细胞水平上表达。 赋予重组DNA以新的生命力。 12 基因工程 肿瘤细胞的转移与细胞表面的糖链类型有关， 而后者又与糖基转移酶的表达相关。 已经证实GnT-与转移有关。 转入GnT-基因 肝癌细胞株SMMC7721 观察其迁移、侵袭、粘附等生物学行为 转入反义GnT-基因 转移 转移 13 基因克隆 分 切 接 转 筛 14 载体和目的基因 载体：vector 在宿主细胞内可独立复制的完整DNA分 子。但必须利用宿主的酶系统，才能有 进一步的基因表达能力。 常用的载体有： 质粒、 噬菌体 、 M13 噬菌体 逆转录病毒DNA、昆虫病毒DNA 载体与宿主共培育可大量生成，经纯化 后可用于基因工程。 15 质粒 质粒：plasmid 环形双链DNA，大小约为数千碱基对， 存在于大多数细菌的胞质中。 拷贝数：每个细菌能容纳的质粒数目。 质粒的性质： 易于从一个细菌转移入另一个细菌。 有两三个抗药性基因。 有一个限制性内切酶切口。 16 质粒 pBR322 ：常用 的质粒 17 噬菌体载体 噬菌体 、 M13 噬菌体 易于感染大肠杆菌 噬菌体DNA比质粒大，对限制性内切 酶有不止一个切口，需经过改造。 一个切口：插入型载体。 二个切口：置换型载体。 18 噬菌体载体 19 目的基因的来源 直接从染色体DNA中分离：原核生物 人工合成：简单的多肽 从mRNA合成cDNA：真核生物 基因文库：(gene library） G文库：用基因组的全部DNA制备。 c文库： 用细胞的全部mRNA制备出全套 cDNA后建库。 20 从mRNA合成cDNA 21 限制性内切酶的应用 限制性内切酶可辨认46个核苷酸：回文结构 回文结构：palindrome DNA双链具有方向相反顺序一致的结构。 平端：blunt end 在同一水平上切断两条链。(钝型末端) 粘性末端：sticky end 碱基序列被酶以错开几个核苷酸的形式切开 。 22 限制性内切酶的应用 Alu I .AGCT .AG CT. 平端 TCGA .TC GA. BamH I GGATCC .G GATTC 粘性 .CCTAGG CCTAAG G 末端 23 限制性内切酶的应用 切载体 切目的基因 限制性 内切酶 相同粘性末端 两者相连 要点：避免切断目的基因 24 载体和目的基因的连接 人工连接器：linker 人工合成的寡核苷酸，安置有限制性内 切酶的识别序列。 DNA连接酶：可用于连接碱基互补的二 段核酸链。 连接方式： 粘端连接方式 尾接法 25 粘端连接 26 尾接法 27 重组体的转化 基因的转移： 重组体进入宿主细胞的过程，已开发了很多 方法。 化学法：CaCl2转移法、碱金属离子转移法 物理法：显微注射法、基因枪法、电穿孔法 生物学法：逆转录病毒载体、腺病毒载体 28 重组体的转化 转化：重组载体导入宿主后，利用宿主 的酶系统表达的过程。即改变宿主性状 的过程。 29 基因工程的表达体系的发展 30 DNA重组体的筛选与鉴定 根据重组载体的表型进行筛选： 如质粒的抗药性、营养素的依赖型 DNA限制酶切图谱分析： 提取经粗选后的宿主DNA，用限制性内 切酶切割后与原来载体比较。 利用核酸杂交和放射自显影进行鉴定： 用目的基因作探针监测宿主DNA是否重 组体。 31 DNA重组体的筛选与鉴定 灭活法 筛选重 组体。 32 提取转化细胞DNA 限制性内切酶 琼脂糖凝胶电泳 与原来载体及重组体比较 DNA重组体的筛选与鉴定 33 DNA重组体的筛选与鉴定 菌落 硝酸纤维素滤膜探针 X线底片 显影 平板 34 基因工程策略 35 第三节、基因工程的应用 生命科学研究趋势 基因诊断和基因治疗 基因工程产品的开发和应用 36 生命科学研究趋势 基因的结构与功能研究 基因表达的调控 各种生物大分子之间的识别及结合 了解生命的奥秘 37 基因诊断和基因治疗 38 基因工程产品的开发和应用 基因工程疫苗：安全廉价 乙肝疫苗、甲肝疫苗 巨细胞病毒、流行性出血热、轮状病毒 、 基因工程生产激素类： 胰岛素、生长激素 细胞因子： 生长因子、肿瘤坏死因子、造血因子、 干扰素 39 第五节、聚合酶链反应 聚合酶链反应：PCR polymerase chain re