兽医专业毕业论文青海半细毛羊血液蛋白多态性及其与7项血清生化指标间的相关性分析

青海半细毛羊血液蛋白多态性及其与 7 项血清生化指标间的相关性分析 摘摘 要要 采用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳法研究了 29 只青海半细毛羊的 HB、ES、AMY1、AMY2 及 TF 5 个蛋白基因位点的多态性及其与 7 项血清生化指标间的相关性，并计算和分析了青海半细毛羊的 遗传变异系数。结果表明：被检青海半细毛羊血液蛋白的 5 个基因位点上，除 AMY1 呈现单态外， 其余均存在多态性。遗传变异系数中，平均基因均质度、平均基因杂合度、平均有效等位基因数 分别为 0.5248 、0.4004 和 2.1507。青海半细毛羊血液蛋白多态性与 7 项血清生化指标间均无 相关性（P0.05)。 关键词:青海半细毛羊，蛋白多态性，遗传变异系数，血清生化指标 CORRELATION BETWEEN POLYMORPHISM OF BLOOD PROTEIN AND 7 SERUM BIOCHEMICAL PARAMETERS IN QINGHAI SEMIFINE-WOOL SHEEP ABSTRACT 29 Qinghai semifine-wool sheep were used to investigate the polymorphism of 5 protein gene locis including HB,ES,AMY1,AMY2 and TF by means of vertical polyacrylamide gel electrophoresis,and analyze the correlation between them and 7 serum biochemical parameters,and the cofficient of genetic variation was calculated.the results showed that: 4 blood protein locis are polymorphic,except that 1 AMY1 showed a single state. the average gene homogeneity index is 0.5248,the average gene 2 heterozygosity is 0.4006 and effective number of alleles. There is no correlation between the blood 3 protein polymorphism and 7 serum biochemical parameters in qinghai semifine-wool sheep. Keyword Qinghai semifine-wool sheep, protein gene polymorphism, cofficient of genetic variation ,serum biochemical parameters 目 录 绪论.5 1 材料与方法5 1.1 试验动物 .5 1.2 血样采集 .5 1.3 测定项目及方法5 1.3.1 血液蛋白多态性的测定和判型 .5 1.3.2 血液生化指标的测定 .5 1.4 数据处理 .5 1.4.1 数据统计.5 1.4.2 计算基因频率和遗传变异系数 5 2 结果5 2.1 青海半细毛羊血液蛋白多态性5 2.1.1 HB 型.5 2.1.2 ES 型.5 2.1.3 AMY 型5 2.1.4 TF 型.5 2.2 基因型频率、基因频率和遗传变异系数.5 2.3 平均遗传变异系数 .5 2.4 血清生化指标.5 3 讨论5 3.1 青海半细毛羊血液蛋白多态性特征5 3.1.2 血红蛋白多态性 5 3.3 不同蛋白多态性与 7 项血清生化指标间的相关性分析5 4 参考文献 .5 致谢.5 绪 论 1 绪 论 自 Smithies(1955)创造淀粉凝胶电泳法以来，国内外学者用电泳方法对不同畜禽品种的血液 蛋白、酶、乳蛋白、卵蛋白、精清蛋白等的多态性及其遗传机制进行了大量深入研究，这些研究大 多用于确定品种间的差异程度，估计品种间亲缘关系，考证品种的起源、进化和驯化过程，或根据 血浆蛋白位点的基因纯合度分析群体的近交程度，或利用血浆蛋白多态性作为遗传标记探讨早期选 种的可能性。青海半细毛羊是青海省培育的品种绵羊，具有对高原低氧环境适应性好，繁殖性能高， 产毛量高，生长发育快，肉用性能好等优点，深受牧民们喜爱。有关青海半细毛羊的血液蛋白多态 性以及血清生化指标测定的研究报道较多，贺晓龙1采用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳法对 48 只 青海半细毛羊血清芳基酯酶多态性及其与血清蛋白质指标间的联系进行了研究；郭朝辉等2对海 北州海晏县 91 只青海半细毛羊的血红蛋白多态性进行了研究；张寿等3对青海河卡种羊场的青海 半细毛羊妊娠期外周血液中孕酮和雌二醇含量、马森4对青海半细毛羊血清 NOS、NO、LDH、SOD、GSH-Px、MDA 进行了测定。研究多为单一的血液蛋白多态性或某几项血清生 化指标或某一两个指标与单一血液蛋白多态性间的相关性分析，且存在着很大的分歧。鉴此，笔者 对青海半细毛羊的血液蛋白多态性及其与 7 项血清生化指标进行了相关性分析，以期为青海半细毛 羊种质资源、亲缘关系以及品种选育和改良等方面的研究提供基础实验资料。 2 1 材料与方法 1.1 试验动物 系青海省海晏县哈勒景乡牧民自繁的成年青海半细毛羊，共 29 只，皆临床健康，试验羊终年 放牧饲养，冬季给予适量的草料补饲，试验动物生活地的海拔高度为 29003400m。 1.2 血样采集 出牧前从试验羊颈静脉采取非抗凝血和肝素钠抗凝血各 5ml，抗凝血样做血红蛋白电泳，非抗 凝血样迅速分离出血清供血清 ES、AMY1、AMY2 以及 TF 电泳以及 7 项血清生化指标的测定。 1.3 测定项目及方法 1.3.1 血液蛋白多态性的测定和判型 1.3.1.1 HB 电泳和分型 采用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳(PAGE)法进行 HB 变异体的分离，按张才骏等5,6介绍的方 法进行，电泳时分离胶浓度为 70g/l，以 pH 8.9 1.5 mol/l Tris-Hcl 缓冲液配制；浓缩胶浓度为 35g/l，以 pH 6.7 0.5mol/l 的 Tris-Hcl 缓冲液配制；电极缓冲液为 pH 8.3 的 Tris-甘氨酸缓冲系 统。电泳时起始电流强度为 20mA，15min 后调到 25mA，稳流电泳 3h。分型标准判型参考佐佐木清 纲7的研究记载。 1.3.1.2 ES 电泳和分型 采用聚丙烯酰胺凝胶（PAG）垂直平板电泳法进行 ES 表型分析。按贺晓龙1记载的方法进行， 电泳时分离胶浓度为 63g/L，用 pH 8.9 的 Tris-HCl 缓冲液配制,浓缩胶浓度为 35g/L，用 pH 6.7 的 Tris-HCl 缓冲液配制，电泳槽内采用 pH 9.0 硼酸硼砂缓冲液，电泳起始电流为 15 mA，15 min 后增至 25 mA，稳流电泳 23 h。按 Tucker 等（转引自铃木正三，1991）8提出的标准进行 ES 表型判定，即以 -乙酸萘酯为基质，37孵育 15min 内出现紫褐色酶活性区带者判定为 ESA 型，不出现酶活性区带者判定为 ESa 型。 1.3.1.3 AMY 电泳和分型 按胡能书等9记载的聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳法分离所有实验羊的 AMY 同工酶酶谱，同 一样本进行两次电泳，分别用加钙和不加钙的两种 pH 5.0,0.15mmol/L 的醋酸-醋酸钠缓冲液孵育。 AMY 同工酶谱分析根据区带泳动速度、酶活性显现与否、钙离子的影响，参考张才骏等10，11的 记载命名 AMY 同工酶、判定表型和分析酶谱。 2 结果 3 1.3.1.4 TF 电泳和分型 采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳法，按张才骏12记载的方法进行，分离胶 Tris-HCl pH 8.9， 凝胶浓度 7.5%，聚合 1h 以上，浓缩胶 TrisHCl pH 6.8，凝胶浓度 3.5%，聚合 0.5h 以上，以 0.03%溴酚兰做指示剂，缓冲液为 pH 8.3 的 Tris-甘氨酸，开始时电泳电压为 80V，待样品进入浓缩 胶后，电压升至 120V，将电泳槽移入冰箱，至指示剂距胶板下端 1.0-1.5 cm 时停止电泳。剥下胶 片，置 7%乙酸2%甘油溶液中固定 20 min，转入 0.25%考马斯亮蓝染色 30min，然后置 7%乙酸溶 液脱色，不断更换脱色液，直到背景清晰为止。参照铃木正三13标准进行判型。 1.3.2 血液生化指标的测定 血清碱性磷酸酶（AKP）活性：采用磷酸苯二钠比色法；血清总胆固醇（CHO）和血清甘油三 酯（TG）含量：采用酶法；血清高密度脂蛋白胆固醇（HDLC）和血清低密度脂蛋白胆固醇 （LDLC）含量：采用选择性沉淀法；血清谷丙转氨酶（ALT）和血清谷草转氨酶（AST）活性： 采用赖氏法。 以上所用的测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所,批号均为 20090603。所有比色项目均 在 721 分光光度计（厦门分析仪皿厂制造）上进行测定。 1.4 数据处理 1.4.1 数据统计 青海半细毛羊 7 项血清生化指标均采用SPSS 13.0 统计软件处理，以平均值（）标准差 x （SD）表示。不同血液蛋白基因型间的 7 项血液生化指标的差异显著性用 t 检验统计分析。 1.4.2 计算基因频率和遗传变异系数 青海半细毛羊 5 个蛋白基因位点上，根据 HB、TF 电泳变异体受共显性等位基因控制的假设和 ES、AMY1、AMY2 电泳变异体受显隐性等位基因控制的假设，由所显示的电泳表型直接推断基因型， 计算基因频率。 基因杂合度按公式 H =计算 2 1 i P 式中 Pi为某一位点第 i 个等位基因频率。 基因均质度指数按公式 HI=（n/n-1）(P21+P22+P2n)-1/n 计算 式中 n 为等位基因数，P1，P2，Pn为基因频率。 有效等位基因数按公式 = 式中 Pi为某一位点第 i 个等位基因频率。 4 2 结果 2.1 青海半细毛羊血液蛋白多态性 2.1.1 HB 型 青海半细毛羊的红细胞溶血液经 PAGE，均分离出 HBA 和 HBB 两种变异体，构成 HBAA、HBAB 和 HBBB 三种基因型(见图 1)。 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 1010 1111 1212 1313 1414 1515 1616 1717 1818 1919 2020 2121 2222 2323 2424 2525 2626 2727 2828 2929 图 1 青海半细毛羊 HB 电泳图谱 2.1.2 ES 型 青海半细毛羊 ES 基因位点上由 ESA和 ESa等位基因控制，存在 ESA 和 ESa 两种表型而呈现多 态性（见图 2） 。 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 1010 1111 1212 1313 1414 1515 1616 1717 1818 1919 2020 2121 2222 2323 2424 2525 2626 2727 2828 2929 图 2 青海半细毛羊 ES 电泳图谱 2 结果 5 2.1.3 AMY 型 被检羊的血清经电泳分离出 AMY1，AMY2 和 AMY3 三种表型，即 AMY1 的泳动速度最快， 全部试验羊都显现一条酶活性区带(见图 3)；AMY2 在没有钙离子的孵育液中不显现酶活性，在含 有钙离子的孵育液中，8 只实验羊显现酶活性区带，而其余 21 只不显现酶活性(见图 4)；AMY3 同 工酶位于电泳起始部。 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 1010 1111 1212 1313 1414 1515 1616 1717 1818 1919 2020 2121 2222 2323 2424 2525 2626 2727 2828 2929 图 3 青海半细毛羊 AMY1 电泳图谱 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 1010 1111 1212 1313 1414 1515 1616 1717 1818 1919 2020 2121 2222 2323 2424 2525 2626 2727 2828 2929 图 4 青海半细毛羊 AMY2 电泳图谱 2.1.4 TF 型 青海细毛羊中从阳极到阴极共分离出 A，G，B，L，C，D，E 共 7 个电泳变异体。它们分别受 TFA、TFG、TFB、TFL、TFC、TFD、TFE7 个共显性等位基因的控制（见图 5） 。 1 1 2 2 ADAD 3 3 ACAC 4 4 5 5 ADAD 6 6 B B 7 7 ADAD 8 8 9 9 1010 ACAC 1111 1212 1313 1414 1515 1616 ACAC 1717 1818 B B 1919 2020 2121 2222 2323 2424 ADAD 2525 2626 2727 2828 2929 图 5 青海半细毛羊 TF 电泳图谱 6 2.2 基因型频率、基因频率和遗传变异系数 被检青海半细毛羊不同血液蛋白基因型频率、基因频率、遗传变异系数见表 1。 表 1 青海半细毛羊不同蛋白基因型频率、基因频率、基因杂合度和基因均质度指数 位点基因型频率基因频率 HH.I.Ne ESESA 0.6897ESA 0.44300.49360.20331.9747 Esa 0.3103ESa 0.5570 HBHBAA 0.1973HBA 0.43100.49040.49221.9623 HBAB 0.5862 HBAA 0.2759HBB 0.5690 AMY1AMY1A 1.000AMY1A 1.00000.00001.0001.000 AMY10 0.000AMY20 0.0000 AMY2AMY2A 0.2759AMY2A 0.14910.26380.73741.3401 AMY20 0.7241AMY2O 0.8509 TF A 0.0344TFA 0.10350.78110.19104.5767 AC 0.0690TFB 0.1552 AM 0.0690TFC 0.2414 B 0.1034TFD 0.3448 BD 0.0690TFE 0.0172 LC 0.0345TFG 0.0517 LD 0.0690TFL 0.0517 C 0.1724TFM 0.0345 CE 0.0345 GB 0.0345 GD 0.0690 D 0.2413 2.3 平均遗传变异系数 表 3 青海半细毛羊 5 个蛋白基因位点的平均基因杂合度、平均基因均质度指数、平均等位基因 有效数 H H H.I.H.I. NeNe 3 讨论 7 0.40040.4004 0.52480.5248 2.15072.1507 2.4 血清生化指标 被检青海半细毛羊不同血液蛋白基因型的 7 项血清生化指标见表 2。 表表 2 2 不同血液蛋白基因型不同血液蛋白基因型 7 7 项血清生化指标项血清生化指标 基因型甘油三 酯 （mmol/ L） 总胆固 醇 （mmol/ L） 高密度 脂蛋白 胆固醇 （mmol/ L） 低密度 脂蛋白 胆固醇 （mmol/ L） 碱性磷酸 酶 (IU/L) 谷丙转氨酶 (IU/L) 谷草转氨 酶 (IU/L) ESESA(n=20)0.980 .45 3.570 .76 3.230 .87 1.070 .66 586.341 4.32 230.8813 6.03 127.866 0.18 ESa(n=9)0.970 .35 3.670 .72 2.770 .72 0.860 .41 566.651 8.89 257.7222 4.54 138.868 6.18 HB AA(n=4) 0.700 .45 3.920 .84 2.761 .13 0.550 .08 575.171 9.04 611.7928 4.89 123.361 5.67 HB BB(n=8) 1.070 .36 3.390 .82 3.280 .62 1.250 .72 586.015 .38 300.0622 1.88 142.866 9.35 HB HB AB(n=17) 1.000 .42 3.620 .68 3.060 .99 1.050 .53 578.582 1.53 273.3931 8.06 110.528 0.68 AMY2 A(n=8) 0.950 .39 3.910 .74 3.230 .95 1.000 .44 579.442 3.87 243.3818 2.70 155.704 1.17 AMY 2 AMY2 0(n=21) 1.020 .44 3.480 .72 3.030 .93 1.050 .63 580.461 6.02 237.5516 2.03 121.867 4.35 3 讨论 3.1 青海半细毛羊血液蛋白多态性特征 3.1.1 酯酶多态性 张才骏等14按 ESa位点的基因频率将绵羊分为两大类群，第一类群以 ESa 为绝对优势，第二类 群以 ESA和 ESa基因频率大致相等来分类。被检青海半细毛羊 ES 基因位点上由 ESA和 ESa等位基因 8 控制，存在 ESA 和 ESa 两种表型而呈现多态性， ESA和 ESa基因频率分别为 0.4430 和 0.5570。试 验结果表明青海半细毛羊与欧拉羊、藏羊一样，同属于第二大类群。 3.1.2 血红蛋白多态性 血红蛋白在动物体内担负着运送氧气和二氧化碳的重要生理功能，是机体的重要生化遗传标记， 也是目前研究得最多的血液蛋白质之一。自 Harris 等15 用纸电泳法鉴定出绵羊 HBA 和 HBB 两个 类型以来，又相继发现了 HBC16，HBD17和 HBE18。由实验结果可见，青海半细毛血红蛋白多态 性只存在 HBA 和 HBB 两种变异体，构成 HBAA,HBAB 和 HBBB 三种基因型，且 HBA 和 HBB 基因频率分 别为 0.4083 和 0.5917。 张才骏等5对生活在不同海拔的藏绵羊的 HB 多态性进行了研究， 发现 HBA 基因频率随着海拔高度的升高而增加（由 0.2903 至 0.9324） ，本试验中青海半细毛羊生活在海 拔高度为 29003400m 的地区，其 HB 位点的 HBA 基因频率为 0.4310，低于生活在海拔 3500 m 左 右的欧拉型藏羊 HB 位点的 HBA 基因频率 0.7990，这与上述观点一致。 3.1.3 淀粉酶多态性 由实验结果可见，AMY 存在 AMY1,AMY2 和 AMY3 三种同工酶，AMY2 同工酶只在加钙的孵育液中 显现酶活性，AMY1 和 AMY3 同工酶只有一条酶活性区带而呈单态，AMY2 同工酶具有显现酶活性的 AMY2 A 和不显现酶活性的 AMY2 O 两种表型而表现出多态性，该结果与其他品种羊19，20的研究结 果一致。 3.1.4 运铁蛋白多态性 转铁蛋白是一种能转运的结合蛋白，广泛分布于脊椎动物的体液及细胞中，分血清转铁蛋白， 卵转铁蛋白，乳转铁蛋白三种，其中以血清转铁蛋白含量最多，广泛分布且提供机体绝大多数器官 所需的铁。青海半细毛羊运铁蛋白多态性与兰州大尾羊21的相比，具有基因型多（12） ，基因杂合 度高（0.7811）的特点，表明青海半细毛羊在 TF 位点上具有丰富的生物多样性和高度的遗传变异 性。另外，青海半细毛羊 TF 多态性中，TFD为优势基因，而在小尾寒羊22 的 TF 多态性中 TFC为优 势基因，此差异与品种有关。 3.2 遗传变异系数分析 被检青海半细毛羊的 5 个蛋白基因位点的平均基因杂合度、平均基因均质度指数和平均有效等位基 因数分别为 0.4004、0.5248、2.1507。其中平均基因杂合度与张才骏23在青海半细毛羊血液生化 遗传多态性的研究中的所得的平均基因杂合度（0.4086）较为接近。本试验中青海半细毛羊基因杂 合度较小，基因均质度较高，说明在经历了杂交、变异、选择、遗传漂变等许多因素的影响下，它 们仍旧能保持高的基因一致度。 3.3 不同蛋白多态性与 7 项血清生化指标间的相关性分析 血液生理生化特性是动物长期进化的结果，是对栖息环境长期适应的反映，也是反映机体健康 状况的重要指标。血清中的 TG 、TCHO、HDL 和 LDL 含量可反映机体对脂类的吸收及代谢程度24。 3 讨论 9 而 AKP、ALT、AST 是动物代谢过程中重要的调控酶，其活性不仅反映动物体内成骨细胞活性及骨生 成状况的生成指标，同时也反映钙、磷代谢以及诊断心、肝功能的重要指标25，26。血液蛋白(酶) 多态性作为一种重要的生化遗传标记，已被广泛地应用于探讨畜禽品种的起源、进化及品种间的亲 缘关系，并利用这些标记作为遗传监测，来进行早期选育的辅助标记。由表 2 可见，青海半细毛羊 7 项血清生化指标在不同血液蛋白多态性型间均无显著差异( P 0.05)。此结果与贺晓龙1、张 才骏等19、王勇等27的研究结果相似。 4 参考文献 11 4 参考文献 1贺晓龙.青海半细毛羊血清芳基酯酶多态性及其与血清蛋白质指标间的联系J.青海畜牧兽医学 院学报，1997，14（2）：17-19. 2郭朝辉，才尕，贾玉刚.青海半细毛羊蛋白多态性的研究J.草与畜杂志，1998， （4）： 18-19. 3张寿，王应安，张勤文，等.青海毛肉兼用半细毛羊妊娠期外周血液中孕酮和雌二醇含量的测定 J.中国兽医科技，1999，1（3）：8-9. 4马森.青海半细毛羊血清 NOS_NO_LDH_SOD_GSH_PX_MDA 测定结果C.动物生理生化学分会第八次 学术会议暨全国反刍动物营养生理生化第三次学术研讨会论文摘要汇编，2004， （1）： 147-147. 5张才骏，张武学，张更利，等.青海省绵羊血红蛋白多态性的研究J.青海畜牧兽医学院学报， 1993，10（2）：8-13. 6张才骏，张武学，张更利，等.青海省环湖地区绵羊血红蛋白多态性的研究J.青海畜牧兽医学 院学报，1987， （1）： 19-23. 7佐佐木清纲 .家畜的血液型及其应用 M.李世安译.上海:上海科学技术出版社， 1982.207-209. 8铃木正三，池本卯典，向山明孝 .比较血型学 M.程光潮，韩建林，杨华林，等译 .北京：中国科学技 术出版社， 1991，226-231. 9 胡能书，万国贤.同工酶技术及其应用M.长沙：湖南科学技术出版社.1985.112117. 10张才骏，张武学，张贞林，等.青海细毛羊血清淀粉酶的多态性研究J.中国养羊， 1994，4：22-24. 11张才骏，李军祥.青海藏羊血清淀粉酶多态性的研究J.青海畜牧兽医杂志，1994，24（5）： 7-9. 12 张才骏.青海绵羊血清铁传递蛋白的电泳研究J.动物医学进展，1997，18（3）：23-26. 13铃木正三著.比较血型学M.程光潮，韩建林，等译.北京: 中国科学技术出版社，1991. 190- 237. 14张才