全封闭式集菌培养法与直接接种法的无菌试验比较.doc

全封闭式集菌培养法与直接接种法的无菌试验比较 【摘要】 目的 比较全封闭式集菌培养法与直接接种法在生物制品无菌试验中的优缺点，以确定更优良的方法做无菌试验。方法 用全封闭式集菌培养法和直接接种法检验成品中染菌情况。结果 用全封闭式集菌培养法的成品复试率明显低于用直接接种法。结论 生物制品无菌试验用全封闭式集菌培养法优于直接接种法，复试率明显降低，检测质量及可靠性增加，同时减少了转种的麻烦，也减少再次污染的机会，解决了无菌试验中一大问题。 【关键词】无菌试验；全封闭式集菌培养法；直接接种法compare the total enclosed cultivator with the direct inoculation in biological products aseptic experimentabstract: objective compare good and bad points of the total enclosed cultivator with the direct inoculation in biological products aseptic experiment, and determined that a finer method performs the aseptic experiment. methods use the total enclosed cultivator and the direct inoculation to test the infection of the final products. results the rate of the final product retest of the total enclosed cultivator is lower than direct inoculation. conclusion the total enclosed cultivator is better than direct inoculation in biological products aseptic experiment, the rate of the retest clearly down, the quality and the dependability of the test advance, and at the meantime decrease the trouble of subcultivation and the chance of recontamination, so it solves a big problem of aseptic experiment.keywords: aseptic experiment total enclosed cultivator direct inoculation无菌检查是药品和生物制品保证质量的重要环节，中国药典三部明确规定：“无菌试验检查法系用于确定无菌的生物制品、原料和辅料及要求无菌的其他品种是否无菌的一种方法”。注射剂生产要求最严，注射剂最基本的要求是无菌、无热源、无不溶性物质。而无菌试验用培养基的质量对检出结果影响很大。1全封闭式集菌培养法是薄膜过滤法的一种，是利用微孔滤膜（滤膜的孔径应0.45um）阻截细菌，以过滤样品中的可溶性成分，从而使样品中污染的杂菌得以检出的一种实验方法，具有简便、快速、准确的特点。2过去，无菌试验中全封闭式集菌培养法只用于血液制品，而生物制品一直采用直接接种法。然而直接接种法，对有些无抗菌作用的药品因培养管浑浊不易进行结果判断3，更随着产品质量意识的提高，加之全封闭式集菌培养法优势即：灵敏度高，操作封闭，不易造成人为操作的污染，吸取全量，不易漏判等，生物制品无菌试验逐渐采用全封闭式集菌培养法。长期以来，一直困扰着生物制品无菌试验的就是复试率较高，特别是气温较高时。虽然说某种制品复试率高与制品、分装冻干等因素有关，但往往复试后制品又合格，重复性不是很好。基于这点，我们用全封闭式集菌培养法与直接接种法对小瓶乙脑疫苗共13批50个瓶号，以及卡舒宁（安瓿）1批6个瓶号，安瓿乙脑5批12个瓶号（初试用直接接种法染菌的）进行无菌试验，结果用全封闭式集菌培养法初试合格率明显高于用直接接种法，复试率或者复试不合格率低于用直接接种法。 1对象和方法 1.1达到gmp要求的无菌操作室，20-25和30-35孵室各一间。 1.2仪器：hty-2000a集菌仪器、集菌器（滤膜0.45um孔径，型号：dcn330） 1.3培养基：硫乙醇酸盐（克氏瓶、血浆瓶、中管），改良马丁（血浆瓶、中管），肝斜面（中管），由本所培养基室提供。必须在30-35 孵室孵放3-7天后无菌生长才能使用； 1.4试验用品：无菌sml、loml注射器，无菌操作眼、剪刀、镊子，无菌0. l%蛋白陈水或生理盐水，塑料桶、铝箱、铝盒、中管架经消毒液浸泡或擦洗后八操作室，酒精炉75%酒精棉、500ppm爱尔施消毒液； 1.5待检品：小瓶乙脑疫苗50个瓶号，以及卡舒宁6个瓶号，安瓿乙脑12个复试瓶号，用500ppm爱尔施消毒液浸泡40分钟后倒出消毒液入操作室紫外线照射至少两个小时； 1.6全封闭式集菌培养法：在无菌状态下，抽取样品通过集菌器（3管），再用灭菌生理盐水或蛋白胨水冲洗滤膜至少3次，每次200ml，再把硫乙醇酸盐（血浆瓶）、改良马丁（血浆瓶）培养基打入集菌器内，试验完后，一管硫乙醇酸盐放入30-35，其余两管放入20-25孵室，14天后判定结果； 1.7直接接种法：含防腐剂的制品（如乙脑疫苗）先在克氏瓶里增菌培养（20-25孵室）3-4天后再转种于3种培养基中，克氏瓶及疏盐、肝斜面各一半培养基及改良马丁培养基放于20-25孵室，另一半硫盐及肝斜面培养基放于30-35 孵室，至少再等10-11天后才能判定结果； 1.8不含防腐剂的制品（如卡舒宁）直接接种在硫盐、肝斜面、改良马丁培养基中，一半硫盐及肝斜面培养基放于30-35孵室，剩余的全部放于20-25孵室，至少14天后才能判定结果。 2结果 2.1小瓶乙脑疫苗用两种无菌试验方法的初试比较对小瓶乙脑疫苗13批共50个瓶号用全封闭式集菌培养法和直接接种法进行初试，结果表明用全封闭式集菌培养法全部合格，初试合格率100%，复试率为o%。用直接接种法有46个瓶号合格，4个瓶号复试，初试合格率92%，复试率8%。见表l。表1 小瓶乙脑疫苗13批50个瓶号初试情况批号（瓶号）全封闭式集菌培养法直接接种法xxxx(1-4#)合格合格xxxx(1-4#)合格1#、2#合格；3#、4#复试*xxxx(1-4#)合格1#、2#合格；3#、4#复试*xxxx(1-4#)合格合格xxxx(1-4#)合格合格xxxx(1-4#)合格合格xxxx(1-4#)合格合格xxxx(1-4#)合格合格xxxx(1-2#)合格合格xxxx(1-4#)合格合格xxxx(1-4#)合格合格xxxx(1-4#)合格合格xxxx(1-4#)合格合格复试率（初试合格率）0（100%）8%（92%）*表示这4个瓶号再用直接接种法复试后全部合格。2.2卡舒宁用两种无菌试验方法的初试比较 对卡舒宁6个瓶号用全封闭式集菌培养法和直接接种法进行初试，结果表明用全封闭式集菌培养法初试合格率100%，复试率为0。用直接接种法初试合格率为0，复试率100%。见表2。表2卡舒宁6个瓶号初试情况瓶号全封闭式集菌培养法直接接种法1#合格复试*2#合格复试*3#合格复试*4#合格复试*5#合格复试*6#合格复试*复试率（初试合格率）0（100%）100%（0%）*用直接接种法复试， 1#、2#、3#、5#、6#合格，而4#复试不合格。其实这个不合格瓶号在48支培养基中仅有1支改良马丁染菌而判为不合格。用直接接种法初试合格率为0，而复试合格率是83%。像这种情况，重复性极其不好，以后用全封闭式集菌培养法可以避免类似情况。2.3安瓿乙脑用两种无菌试验方法的复试比较对于含防腐剂制品染菌情况的，用全封闭式集菌培养法是否存在抑菌，我们对5批安瓿乙脑共12个瓶号（初试用直接接种法染菌的）进行复试。结果表明，用全封闭式集菌培养法有6个瓶号复试不合格，复试不合格率50%，直接接种法有9个瓶号复试不合格，复试不合格率为75%。还可知有5个瓶号用这两种方法都出现染菌现象，见表3。表3安瓿乙脑5批12个6个瓶号的复试情况批号全封闭式集菌培养法直接接种法xxxx(2#，4#，11#)11#复试不合格，2#，4#复试合格2#，4#，11#复试不合格xxxx(7#，8#)7#复试不合格，8#复试合格7#，8#复试不合格xxxx1#，6#，7#)1#复试不合格，6#，7#复试合格6#复试不合格，1#，7#复试合格xxxx(2#，3#，5#)2#、5#复试不合格，3#复试合格2#、5#复试不合格，3#复试合格xxxx(2#)2#复试不合格2#复试不合格复试不合格率50%75%表3结果说明有菌的用全封闭式集菌培养法一样会出现染菌现象，不存在抑菌情况，而且复试不台格率低于用直接接种法。 3讨论 历来，怎样降低无菌试验复试率一直是无菌试验检定最关心的焦点，虽然染菌与其它环节有关系，但用全封闭式集菌培养法降低复试率无疑是一种优选的方法。因为直接接种法操作环节较多，易造成操作过程中再污染，比如：注射器灭菌处理未彻底：培养基接种中管支数太多（初试24支，复试48支）暴露在外的培养基塞子只要有一支未控制好就会有菌掉入培养基中出现染菌：准备工作繁琐，若有一支染菌培养基未发现被选用；平时观察较困难，培养基搬来搬去，塞子易松易掉而掉人外界菌，还有由克氏瓶转接中的过程等。而全封闭式集菌培养法在很大程度上克服了这些，把外界影响和操作者的主观因素减少到最低，又增加了取样量，较直接接种法更为客观、公正、科学，能够全面反映样品的染菌情况。该法是药学领域中用作无菌培养的成熟技术，常用来作注射剂的无菌检查4，并被收入2010 年版中国药典5。其优点是可对样品全量过滤集菌，整个过程在封闭状态下进行，操作不易污染，重复性好。 全封闭式集菌培养法只用2种培养基，没有肝斜面。硫乙醇酸盐可检测需氧兼厌氧菌，改良马丁检测真菌，而肝斜面也可检测需氧兼厌氧菌，所以只用两种培养基不用肝斜面是可行的。 综上所述，用全封闭式集菌培养法优于直接接种法，只要用来实验的样品是可溶解过滤的，同时又不影响样品中微生物的生存状态时，就可以用该法检验。同时，该法的用途非常广泛，几乎可以运用到每一种剂型的药品检验中去。欧洲、美国、英国、日本的药典均有收载。我国药检工作者近几年也开展了大量的有关工作，做了许多实验研究，对于这种方法用了更深刻的认识和更广泛的运用，这对于在药品检验技术上的提高和我国与国际接轨，药品质量控制以及药品监督执法等工作都有重要而深远的意义。2参考文献1 谢文,赵宏大,纪绍梅.关于我国药品无菌试验用培养基质量的现状分析及改进建议.中国药事,2010,24（