外文翻译山楂果中抗氧化性物质的研究

山楂果中抗氧化性物质的研究张泽生a,常琪b,朱敏b,黄玉c, Walter K.K. Ho a,陈振宇a,*（a香港中文大学 生物系，中国香港 新界 沙田；b香港中文大学 制药系，中国香港 新界 沙田；c香港中文大学 物理系，中国香港 新界 沙田）摘要 研究表明，山楂果提取物对人体有很多益处，可以保护低血压和心血管，还可降低胆固醇。目前，有人对山楂提取物的抗氧化性及其对人体氧化性物质低密度脂蛋白和-生育酚的影响做了进一步的研究。依次使用乙醚、乙酸乙酯、丁醇和水对干山楂果进行提取，发现乙酸乙酯是唯一能有效抑制Cu2+氧化低密度脂蛋白的物质。使用色谱分离技术可得到八种纯化合物，即：熊果酸，金丝桃甙，异槲皮甙，儿茶素，绿原酸，槲皮素，芦丁和原儿茶酸。除了熊果酸，所有这些酚类化合物都可以保护人体内的低密度脂蛋白不被Cu2+氧化成氧化低密度脂蛋白。同时还能有效防止-生育酚氧化诱发的过氧自由基对体内低密度脂蛋白的作用。这些化合物对抑制低密度脂蛋白和-生育酚的氧化具有剂量依赖性，即浓度为540M。此外，与对照组相比，在加有30%不饱和油的大鼠饮食中补充2%的山楂粉可显著提高鼠血清中18%20%的-生育酚。最新研究结果表明，山楂果一方面有保护心血管的作用，同时也可能对直接保护人体低密度脂蛋白不被氧化或通过维持一定浓度的-生育酚间接保护人体低密度脂蛋白有一定的作用。2001埃尔塞维尔科技股份有限公司版权所有。关键词 黄酮类化合物；山楂果；低密度脂蛋白；-生育酚前言 山楂是一种亮红色的山楂属植物。长期以来被用作民间医药。药理学和毒理学研究表明,食用山楂果对降低因长期药用而对心血管功能产生的副作用有好处1-3。山楂提取物已被用来治疗早期充血性心力衰竭4,5和心绞痛6，在临床上，可有效降低血压和血浆总胆固醇7。目前，对山楂提取物的这些保护作用机制的了解仍然甚少，但其表现出的抗氧化性的作用机制已有部分了解，认为是由于这些提取物可以减少体内自由基的产生，从而减轻后续组织对心脏的损害和减少动脉沉积胆固醇。然而，目前山楂果的抗氧化性还没有得到充分的认识。人体内氧化修饰的低密度脂蛋白对促进动脉粥样硬化可能发挥重要作用8-14。这一假说支持以下几个说法：(a)目前，氧化改性低密度脂蛋白（氧化型低密度脂蛋白）存在于动脉粥样硬化斑块而不存在于正常的动脉壁9；(b)氧化型低密度脂蛋白采用了巨噬细胞清道夫受体，促进胆固醇酯积累和泡沫细胞的形成10；(c)氧化型低密度脂蛋白对内皮细胞有毒并且刺激单核细胞粘附于内皮细胞10。-生育酚（维生素E的主要形式）是一种重要的保护低密度脂蛋白不被氧化的抗氧化剂15,16。有研究表明，增加维生素E的摄入量可减少低密度脂蛋白的氧化、血小板粘附以及血栓的形成17-23。流行病学数据还表明，维生素E补充剂和低风险的冠心病相关23-25。越来越多的证据表明维生素E的对人类的保护作用中还包括血浆-生育酚的含量与死于心血管冠心病的死亡率呈负相关26-27。 山楂果实富含黄酮类化合物28。估计人类每天摄入的黄酮类物质高达1g29-30。已记录的类黄酮的消费量与冠状动脉粥样硬化性心脏病的死亡率是负相关的31。虽然山楂提取物已被广泛记载具有心脏降压和降低胆固醇的活性，但没有最新的研究来探讨山楂提取物在人类低密度脂蛋白中对脂蛋白和-生育酚的影响。本研究的目的是量化山楂果中的黄酮并研究这些黄酮类物质对人体低密度脂蛋白和-生育酚的抗氧化作用。2、材料和方法2.1 提取、分离并鉴定山楂中的黄酮类物质 从中国河北省性灵县收集山楂果（山楂属裙带菜），去核，冻干果肉，然后用咖啡研磨机研磨成粉。丁等人32用80%乙醇提取并研究了山楂叶的化学组成成分。在最新的研究中，用80%乙醇(5L)室温下24h提取果实粉(1.5kg)三次后，使用真空旋转蒸发仪浓缩回收乙醇滤液，然后将提取物溶于4L水中并用溶剂醚(2L4)、乙酸乙酯(2L4)和正丁醇(2L4)使溶液极性不断增加进行提取。然后再旋转蒸发，分别得到18g的醚、22.5g的乙酸乙酯和94.5g的正丁醇。其余的水层也冻干，得到的提取产物的质量为498g。 初步低密度脂蛋白氧化实验结果表明：只有乙酸乙酯部分显示了强大的抗氧化性。因此，只选择乙酸乙酯并加入到一个硅胶柱(15.58.0cm)中进一步分离提取产物中的抗氧化剂。本柱用0%（4L）、5%（4.5L）、10%（5.5L）和20%（3.3L）的甲醇-氯仿（系统命令增加极性）洗脱，获得四个组分，如图1所示。图1 从山楂果乙酸乙酯部分分离纯化酚类化合物组分1是重新运用硅胶柱以0.8ml/min的流速加入氯仿洗脱而获得的87mg乌克酸（260-380ml）。组分2是向葡聚糖激素20柱（32.533.5 cm编号）中加流速为1ml/min的甲醇-氯仿（1:1，体积比）混合洗脱液洗脱获得50mg原儿茶酸（630-770ml）和13mg槲皮素（770920mg）。组分3 是先向葡聚糖激素20柱（32.533.6cm编号）中加流速为3ml/min的甲醇洗脱获得了140mg儿茶素（1590-2350ml）、103mg金丝桃苷（26403030mg）以及金丝桃苷和异槲皮素的混合物（30303750mg）。所得混合物再在C-18高效液相色谱（HPLC）柱（Waters Nove-Pek C-18 Cartridge, 100.8cm编号，4m）中用流速为3.5ml/ml乙腈和水（15:85，体积比）的混合物洗脱获得25mg异槲皮素（6.3min）。组分4是用硅胶柱以1.2ml/min的流速加入氯仿-甲醇（1:1，体积比）混合液进行洗脱，得到了87mg绿原酸（360-540ml）和13mg芦丁（1080-1260ml）。黄酮类化合物部分以苷的形式存在于水果中。这可能是因为在提取纯化过程中，部分纯化的黄酮类化合物水解成了苷。乙酸乙酯部分纯化得到的八种化合物经核查其化学结构是根据其紫外光谱数据，液相色谱-质谱（LC-MS），1H - NMR和13C NMR并与已公布的数据33-37比较而得出的，参考化合物（图2）。2.2 低密度脂蛋白的分离 从香港中文大学的威尔斯亲王医院的健康人群（20人）中收集新鲜血清并集中起来，立即添加乙二胺四乙酸（EDTA）（0.1%）和叠氮化钠NaN3（0.05%）溶液以防止脂蛋白的氧化修饰。从血浆中分离低密度脂蛋白，同时根据此方法还可应用于其他方面38。简言之，先将1500g血清离心15min去除细胞和细胞碎片，然后添加NaCl-KBr溶液（1L水中溶解了153gNaCl，354gKBr和100gEDTA，密度为1.33g/ml），血清密度增加到1.019，再加血清至160,000g，在4条件下离心20h。之后，最高层含有乳糜微粒和极低密度脂蛋白，剩下的血清部分的密度增至1.064，然后在增加血清至160,000g，再离心24h。收集并用氮冲洗顶层的低密度脂蛋白部分并储存于-70的环境中。被分离出的低密度脂蛋白中的蛋白质含量用Lowry的方法39测定，总低密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯测定使用Sigma酶包。结果显示，低密度脂蛋白部分含有5.2mg/ml蛋白质、2.1mg/ml胆固醇和0.8mg/ml甘油三酯。图2 绿原酸、儿茶素、金丝桃苷、异槲皮甙、原儿茶酸、槲皮素、芦丁和熊果酸的化学结构2.3 低密度脂蛋白的氧化 将储存的低密度脂蛋白部分（蛋白5mg/ml）用100体积的含有0.01M磷酸钠、0.9%NaCl、10M EDTA和0.05%NaN3的透析液（PH7.4）中于黑暗处透析24h，透析液共换了4次。然后用0.01M磷酸盐缓冲溶液（PH7.4）将透析后的低密度脂蛋白稀释至蛋白含量为250g/ml。氧化低密度脂蛋白进行了如先前Puhl等人40所描述的实验。为控制孵化管，将0.4ml低密度脂蛋白（250g/ml）与50l 50M CuSO4溶液和50l 0.01M磷酸盐缓冲溶液（PH7.4）混合，在37下孵育长达24h。对于试验管，将0.4ml已预先孵育生物低密度脂蛋白（蛋白250g/ml）与50l不同浓度的某种山楂酚类化合物混合培养5min。然后添加50l 50MCuSO4溶液开始氧化，然后在37下培养24h。通过添加25l 1.0%的EDTA并置于4冷却即可终止氧化。低密度脂蛋白的氧化程度是通过测定反应产物硫代巴比妥酸（TBARS）来反应的，方法与以前Buege和Aust41所描述的一样。立即向该LDL-孵育管加入2ml 0.67%硫代巴比妥酸和15%三氯乙酸-HCl溶液。然后将孵育混合物加热至95并保持1h后，在冰上冷却并将1000g离心20min，然后在532nm下测吸光度，从而得出TBARS的含量。用丙二醛（MDA）标准溶液进行校准，TBARS的单位用nmol MDA/mg LDL蛋白质表示。2.4 保护山楂果中的黄酮类化合物不被低密度脂蛋白中的-生育酚影响此处储存的低密度脂蛋白用上述方法进行了透析，通过添加1mM的2,2-azobis盐酸盐（AAPH），一种过氧自由基引发剂，诱导了低密度脂蛋白中的-生育酚的氧化。总之，在40不断搅拌的磷酸钠缓冲溶液（PH7.4，10mM）中培养低密度脂蛋白（蛋白质150g/ml），不同剂量的山楂酚类化合物中加有1.0mM的AAPH。一个完整的孵化液（1ml）是定期结成冰，立即加入含有0.5mg二丁基羟基甲苯（BHT）的1ml乙醇作为抗氧化剂，1.0g生育酚醋酸酯作为内标准物，然后立即用2ml正己烷提取该混合物。正己烷在一个缓和的氮气流下蒸发，所得的提取物在溶解于100l的乙醇，然后再高效液相色谱分析测定低密度脂蛋白中的剩余的-生育酚。低密度脂蛋白中-生育酚含量的测定方法与以前42使用一个日本东京的配备了三元泵输送系统的高效液相色谱Shimadzu LC-10AD的测定一样。简言之，将用乙醇从1ml低密度脂蛋白孵育液中提取的10l提取物通过一个微注射器（20l容量，Cotati，加利福利亚洲，美国）注射到C-18柱，用甲醇作为洗脱剂以2ml/min的流速进行洗脱。然后使用一个二极管探测器在200nm或280nm下探测，并量化-生育酚和所添加的醋酸的数额比，从而测算出-生育酚的量。在低密度脂蛋白的最后的孵化液中的-生育酚的初始浓度被认为是1.5M(0.7g/ml)。2.5山楂果补充剂对大鼠血清-生育酚的影响为了研究山楂果对大鼠体内的-生育酚是否有保护作用，将雄性Spraguge-Dawley大鼠（130-150g，n=32）随机地分为两组，实验组喂的饮食（100g）有：29.3克玉米淀粉，蔗糖10克，20克牛奶，30克菜籽油，纤维素5克，4克艾因-76矿物组合，0.4克重酒石酸胆碱，1克艾因-76A维生素和0.3克蛋氨酸的混合物。山楂组喂相同的饮食，同时补充2%的山楂粉。两组的饮食热量相同，鉴于老鼠食用含30%多不饱和的紫苏油的饲料会有一个较低水平的血浆-生育酚，并且补充绿色茶儿茶素会导致一个单向的增加血浆中的-生育酚43这一事实，我们假设，山楂黄酮类化合物也能提高食用了含有30%多不饱和油饲料的大鼠的血浆-生育酚。所有的动物都可以自由接近水源，在3到6周的隔夜禁食后，每组会有8个动物死亡。通过腹主动脉收集血液，凝固后，1300g血液离心10min，然后收集血清，再使用上面的方法利用高效液相色谱法测量-生育酚。2.5高效液相色谱法分析山楂果中的抗氧化性物质 为了量化山楂果中的这些酚类化合物，采用了一个配备有光电二极管阵列探测器（型号126）的水银金高效液相色谱系统（型号168）的高效液相色谱法，此探测器是一个自动采样并和金搏击的分析工作站。本样本的乙醚，乙酸乙酯，正丁醇和水注射到高效液相色谱柱，以1ml/min的流速加入流动相进行梯度洗脱，流动相（PH2.4）由溶剂A（含有5%乙腈的25M的NaH2PO4）和B（含有25%乙腈的25mM的NaH2PO4）组成。在第一个20min，A和B的比例由9:1变到2:8，再洗脱35min，并在5min之内将两者的比例变回9:1，在278nm和360nm下检测洗脱峰（如图3）。以100g干果粉计算，复合于那四种组分中的酚类化合物的含量都很少，简化表示，只有乙酸乙酯部分在高效液相色谱图中有所显示（如图3）。图3 高效液相色谱显示山楂酚类化合物存在于乙酸乙酯提取物中2.7统计 数据用S.D表示，方差分析是统计评价数据之间差异的方法，山楂补充组使用标准方差表示，当P0.05时，被认为差异显著。3 结果在相同的培养条件下比较比较山楂低密度脂蛋白的醚提取物、乙酸乙酯、丁醇和水部分的抗氧化活性。结果表明，乙酸乙酯部分对低密度脂蛋白有较强的保护作用，因此有针对性地分离和纯化乙酸乙酯部分山楂果抗氧化剂。使用色谱柱分离得到八种纯化合物（如图2和图3）。如表1所示，高效液相色谱分析发现儿茶素的含量最多（178mg/100g干果），其次是绿原酸（65mg/100g干果），金丝桃甙（25mg/100g干果），异槲皮甙（13mg/ 100g干果），原儿茶酸（3mg/100g干果），芦丁（3mg/100g干果）和槲皮素（1mg/100g干果）。这八种从乙酸乙酯部分纯化出来的化合物表现出不同的抗氧化性（如图4）。乌索酸没有抗氧化活性，而金丝桃苷最为保护人类低密度脂蛋白（滞后时间= 9.5h），其次是槲皮素（滞后时间=6.5h）和异槲皮甙（滞后时间=6h；如图4）。在相同的实验条件下，儿茶素，绿原酸、芦丁（滞后时间=4-5h）的抗氧化性是相似的，但明显弱于金丝桃甙，槲皮素和异槲皮甙（如图4）。从山楂果中分离的七种纯化合物（即儿茶酸，绿原酸，儿茶素，槲皮素，芦丁、金丝桃甙，异槲皮甙）对Cu2+保护的低密度脂蛋白的抗氧化性表现出剂量依赖性（如图5）。没有这些山楂抗氧化剂，低密度脂蛋白在4h内氧化显著。在大多数情况下，添加5-10M这些山楂抗氧化剂可延长低密度脂蛋白氧化滞后时间超过8h，如果添加20-40M，则低密度脂蛋白在24h内很少或几乎不发生氧化（如图5）。图4从乙酸乙酯部分分离的山楂酚类化合物（5M）对铜离子氧化人类低密度脂蛋白而产生的硫代巴比妥酸的抑制作用。低密度脂蛋白（蛋白质100g/ml）用来培养含有5M硫酸铜的磷酸钠缓冲溶液（PH7.4），在37C进行氧化，数据用六到八样品的标准差表示。表1图5 从乙酸乙酯提取物中分离的山楂酚类化合物对在Cu2+抑制的人类低密度脂蛋白的氧化作用中产生硫代巴比妥酸的抑制作用存在剂量依赖性。低密度脂蛋白（100g蛋白/ml）存于含有5M CuSO4的磷酸钠缓冲液（pH7.4）中。氧化反应在37C下进行，数据用六至八个样本的标准差表示。从乙酸乙酯部分纯化的八种山楂化合物对人类低密度脂蛋白中-生育酚的保护作用也做了检测（如图6）。观察巴比妥酸测试（如图4）得出：乌索酸对-生育酚没有保护作用。其余七种酚类化合物则表现出不同的保护作用，其中，绿原酸的最强，其次是金丝桃苷，槲皮素和芦丁。与此相反，保护活性异槲皮苷和原儿茶酸是非常类似的，但明显弱于绿原酸，金丝桃甙，槲皮素和芦丁。这七种从乙酸乙酯部分分离的山楂抗氧化剂对低密度脂蛋白中-生育酚的保护作用也表现出了剂量依赖性（如图7）。在大鼠饲料中补充山楂果（2%）可显著增加大鼠血清-生育酚。实验表明，3周后，山楂补充组的大鼠血清-生育酚与控制组的相比，增加了18%；6周后，山楂补充组则增加了20%（如图8）。这两组大鼠的食物摄入量、体重以及器官（肝脏，心脏，肾脏，脑和肾周脂肪组织）重量（数据未显示）没有差异。对这两组大鼠的血清总胆固醇和甘油三酯也进行了分析，但没有显著差异（数据未显示）。由于经过上述分析之后缺乏血清，故本实验没有测定这两组大鼠血清中低密度脂蛋白的氧化。图6 从乙酸乙酯提取物中分离的山楂酚类化合物（5M）对人类低密度脂蛋白中的-生育酚的保护作用。该低密度脂蛋白（150g蛋白/ml）存于磷酸钠缓冲溶液（pH7.4）中，在40下用1mM的AAPH诱发-生育酚的氧化。数据用六至八个样本的标准差表示。图7 从乙酸乙酯提取物中分离的山楂酚类化合物对人类低密度脂蛋白中-生育酚的保护作用存在剂量依赖性。该低密度脂蛋白（150g蛋白/ml）存于磷酸钠缓冲溶液（pH7.4）中，在40下用1mM的AAPH诱发-生育酚的氧化。数据用六至八个样本的标准差表示。图8 补充山楂果粉（2%）对大鼠血清-生育酚的影响。用标准差来评价，n=8，在特定时间点标准差有明显差异，P0.5，P0.1。4 讨论许多对山楂果的药理研究都专注于它对心血管的保护作用1-3。山楂果也被证明能够降压和降低胆固醇4-7。但是，对这些机制的有益影响知之甚少。饮食中的抗氧化剂可能会减少启动和激活体内的自由基，从而尽量减少自由基对心脏组织和心血管的损伤。许多研究表明，人类低密度脂蛋白的氧化是引发心血管疾病的危险因素之一8-14。目前的研究结果表明，山楂果中富含黄酮类抗氧化剂。这些从山楂果中分离纯化的化合物（即，绿原酸，儿茶素，金丝桃甙，异槲皮甙，原儿茶酸，槲皮素和芦丁）对人类低密度脂蛋白具有保护作用。-生育酚是一种重要的保护人类低密度脂蛋白不被氧化修饰的抗氧化剂15,16。几项研究数据表明，男性和女性补充维他命都能降低冠心病的发生2325。高血浆-生育酚人群有一个低心血管疾病死亡率26-27。目前的研究结果表明，山楂果中至少含有七种抗氧化剂。这些化合物能有效地保护-生育酚不被自由基降解。如果说食用山楂果与显著的人类低风险心血管疾病相关，那么，参与的机制可能包括这些抗氧化剂对人类低密度脂蛋白中的-生育酚的保护作用。这七种山楂酚类抗氧化剂抑制低密度脂蛋白氧化的生化机制有以下一种或多种可能性。首先，这些酚类化合物可作为络合剂抑制Cu2+激发自由基，Brown等人44做的光谱研究表明，这些酚类化合物大多数都有螯合Cu2+的能力。其次，他们作为重要的抗氧化剂直接猝灭或减少由Cu2+或恒定的-生育酚激发的自由基的形成。当用APPH代替Cu2+来生成过氧自由基时，这些酚类化合物对人类低密度脂蛋白中的-生育酚仍有强烈的保护作用，从而验证了第二种可能性。为了证明这一点，我们能够实验表明补充了山楂果粉的显著升高了血清-生育酚，这就意味着山楂在体内外对-生育酚都有保护作用。目前，有研究在大鼠的饮食中补充2%山楂果粉。将