药学专业毕业论文 外文翻译

本科毕业论文(设计)外文翻译学 院 专 业药学姓 名 学 号 指导老师 职 称 合作老师职 称题 目Cell-penetrating peptide TAT-mediated delivery of acidic FGF to retina and protection against ischemiareperfusion injury in rats译文：细胞穿膜肽TAT介导的酸性成纤维细胞生长因子对大鼠视网膜缺血再灌注损伤保护作用的影响Cell-penetrating peptide TAT-mediated delivery of acidic FGF to retina and protection against ischemiareperfusion injury in ratsa生物技术重点实验室，浙江省制药工程学院药学院，温州医学院，温州，中国b温州医学院附属眼视光医院，温州医学院，温州，中国c马萨诸塞州综合医院，哈佛医学院，波士顿，马萨诸塞，美国d基因药物国家工程，暨南大学，广州，中国研究中心e工程生物反应器与药物开发，教育部工程研究中心，吉林农业大学，长春，中国f伤口愈合及细胞生物学基础医学院，解放军总医院检验科研究所，军医进修学院，北京，中国公关收件日期：08年11月21日，接受日期：09年4月30日摘要:非发病性眼部给药系统的发展在视网膜疾病治疗过程中具有重大意义。在这项研究中，我们评价在大鼠视网膜上反式作用因子蛋白质转导结构域（TAT-PTD，TAT49 - 57）作为载体转录酸性成纤维细胞生长因子的效能。TAT-aFGF-His从视网膜表面到眼球表面具高效的穿透力。免疫组织化学染色anti-His30分钟后显示在视网膜上具有TAT- aFGF-His蛋白质 （主要在神经节细胞层），并对其继续观察至少8小时后处理。相反，处理后发现His蛋白并没有在视网膜上，这就表示aFG-His不能穿透过眼球屏障。 此外，TAT- aFGF-His，但不是aFGF-His，介导的对视网膜缺血再灌注（IR）损伤有明显的保护作用。 再灌注损伤后，由TAT- aFGF-His处理的大鼠视网膜神经细胞有较好的保护视网膜层结构，降低了视网膜细胞凋亡，与用aFGF-His或PBS处理的视网膜神经节细胞相比能提高视网膜功能，。这些结果表明， TAT-aFGF-His在不丢失其生物效应的同时可以明显提高穿透眼球屏障的能力。 因此，TAT49 - 57提供了在视网膜疾病的治疗中有效的药物潜在传播媒介。关键词：细胞穿透肽；成纤维细胞生长因子；视网膜缺血再灌注损伤；反转录肽前言视网膜是最复杂的眼球组织，它能够处理视觉信息，从视神经到视皮层传输信息。视网膜是受眼球屏障保护的， 包括角膜，房水和血眼屏障，只有很少的物质可以从眼睛外或血液循环穿透这些障碍。虽然视网膜屏障为视网膜功能提供一个稳定的，封闭的微环境功能，但是这些屏障也成为了视网膜潜在治疗药物的挑战。目前，最广泛的在视网膜治疗中运送药物的方法是视网膜下结膜注射，这不仅是一个困难有害的过程，作为慢性病患的治疗也是不实用的。因此，发展损害性给药系统将大大有利于视网膜疾病的治疗。 细胞穿透肽（CCPs）已被报道为细胞内的大分子传递媒介，包括寡核苷酸1，siRNA 2，肽和蛋白质3，纳米粒子4，铁珠4，质粒5和脂质体6。艾滋病毒的反转录肽（TAT）是广泛研究的对象之一。达显示TAT在体内外能间接输送生物因子。它能够转运到活细胞和穿透生物障碍（如血脑屏障），为临床药物输送7，8提供新型运输潜在工具。在这项研究中，我们检测了TAT从眼球表面到大鼠视网膜转运酸性成纤维细胞生长因子（aFGF19- 154）的潜力。 aFGF（也称为FGF -1）是生长因子家族中一个最强大且广谱的有丝分裂原。 aFGF在外胚层和中胚层细胞，伤口愈合，造血，血管生成，炎症过程以及肿瘤的发生中调节发育和形态 9-16。 aFGF也有报道能有效保护缺血再灌注（IR）损伤的脑和心脏组织17，18。我们的研究结果表明，TATaFGF-His，但不是aFGF-His，可以有效地穿透眼对视网膜屏障，是IR损伤有力的保障。材料和方法动物 雄性SD大鼠，体重250-300g（约18周岁）由温州医学院实验动物中心获得（温州，中国）。动物安置在一个恒定的室温，以12:12小时光/暗循环，给予标准的啮齿类动物饮食和水。协议包括由温州医学院动物政策及福利委员会提供的动物使用权。缺血再灌注模型 大鼠以10水合氯醛腹腔注射麻醉 （3mL/kg）。局部麻醉灌输0.5丙美卡因盐酸到角膜5分钟。眼睛用氧氟沙星（江苏KWin的制药有限公司，江苏，中国）弄湿。整个过程的时间间隔为10分钟。该左右眼的前房用导管插入一个27G空心针连接到盐水域。60分钟后，视网膜缺血引起的右眼提高眼内压（IOP）至110mm汞柱，保持眼水域在右眼150cm以上，而作为对照的左眼在先前描述的过程中不增加眼内压19。视网膜缺血用眼底镜检查发现视网膜动脉和球结膜蛋白红反射消失。 经过60分钟的缺血时间，针从前房摘除，再灌注视网膜动脉在眼底检查中可以看到眼底视网膜红反射。aFGF-His和TAT aFGF-His融合蛋白的制备与处理如前所述，aFGF-His的融合蛋白和TAT aFGF-His是在我们的实验室产生的20。简言之，TAT- aFGF-His的基因，PCR扩增，PET - aFGF19 154质粒由正向引物F1的质粒 （5,-GGAATTCCATATGCGCAAAAAACGTCGTCAGCGTCGCCGTGCTAACTACAAG 3,）和反向引物R（5,- GCAGATCTTTAGTGATGATGATGATGATGATCAGAAGAAACTGGCAA - 3,）完成。TAT和His的序列分别包括引物F1和R。将扩增 片段融合到pET3c载体上。另一种表达载体PET- aFGF-His，通过如上所示相同的程序，引物为F2，但是没有TAT序列和反向引物R。两个表达载体克隆到大肠杆菌BL21（DE3）中。重组 aFGF-His和TAT aFGF-His在PBS中溶解。一个容积为2gaFGF-His或TAT-aFGF-His溶解在40L溶液（50g/mL）中， 在老鼠眼睛缺血条件下对其表面局部麻醉，同时管理组用PBS同样给药。在实验过程中检测穿膜肽穿透眼组织的能力（图1），aFGF-His，TAT- aFGFHis 或相同体积的PBS眼睛给药一次收获不同给药时间点。对于缺血再灌注损伤的保护实验中，aFGF-His，TAT- aFGFHis或相同体积的PBS 分别分别对缺血再灌注损伤在0天，2天和4天三个时间点给药。免疫组织化学法组织穿透的aFGF-His和TAT- aFGFHis进行了评估，用兔anti-His多克隆抗体做免疫组织化法的方案。简单地说，大鼠在CO室处死后，摘除双眼，用4福尔马林室温固定过夜，处理后用石蜡包埋。石蜡包埋组织切片（4m厚）沿垂直子午线通过视神经眼头。只有部分包含整个视网膜与视神经头部可见部分用于免疫组织化学分析。组织切片进行染色，主要用兔抗他多克隆抗体（1:1000），信号检测生物素兔抗体IgG和一套抗蛋白链菌素。组织学鉴定视网膜缺血再灌注损伤摘出缺血性（右眼）和非缺血性眼（左眼），通过锯状缘沿着冠状缝切面将其切成两半。玻璃体已被摘除，并把眼睛的后半浸在4多聚甲醛24小时，然后切片，苏木精和曙红染色。分析样本内核层（INL）和神经节细胞层（GCL）的细胞形态。在GCL上，从视网膜开始到视盘的100 m视网膜长度选定五个可视区域进行计数来检测细胞数量，视网膜神经节细胞（RGCs）在视神经细胞层，有规则的形状和排列整齐的大凝结核。以形态为基础，确定并计算细胞量。我们标准的结果是在同一只大鼠身上设置对照组（左眼）和实验组（右眼）。暗适应视网膜电图（ERG）记录在缺血再灌注后的1,3和7天，从右眼同时发出的红外光谱可以记录ERGs。大鼠放置暗室2小时后经暗淡的红光处理。由10%水合氯醛麻醉后用0.5丙美卡因盐酸局部麻醉角膜上，然后用0.5去氧肾上腺素盐酸和0.5托吡苯盐酸使斜瞳孔扩张到最大。该记录电极分别在巩膜边缘放置，参比电极空心插入面颊皮下，并在动物下放不锈钢板用作接地电极。每次刺激（光功率0 cds/m2和带通滤波是从1到300赫兹）响应者为250ms的时间。这强烈的a波，b波和OPS波（振荡电位）由RETI2视觉电扫描探探测机记录（罗兰咨询，勃兰登堡，德国）。TUNEL染色及凋亡分析TUNEL染色进行的石蜡包埋切片根据手写的协议使用原位细胞死亡检测试剂盒。简言之，切片，脱蜡，复水，并在20g/ml蛋白酶K溶液中孵育3720分钟的方案。载玻片用PBS漂洗（3分钟，三次），晾干，并于20微升的TUNEL反应混合物中37孵育1小时，用PBS冲洗样品（3分钟，三次）使反应终止，加入20L流器- POD溶液37孵育30分钟 ，用PBS漂洗后（3分钟，三次），加入50LDAB于样品内37%孵育45秒，重新与苏木精染色10秒。洗净后，1氨水漂洗，再利用不同浓度的酒精水化，对切片进行密封，并通过光镜检测。 TUNEL法（凋亡）细胞计数为在GCL周围视神经盘定量统计10个视野（每个视野6000）内的棕色细胞数，数据作为每平方毫米活细胞数（平均S.D.s）。统计分析资料分析采用单项方差分析，Dunnett T3的SPSS的V15.0。P值小于0.05认为是重要的。结果经过对眼球表面局部处理后，TAT穿透肽介导传递aFGF到视网膜要确定穿膜肽能穿透眼球屏障，介导aFGF到视网膜的能力，我们比较aFGF- His和TAT- aFGF- His在大鼠眼睛经过局部处理后的组织穿透力。 眼睛经过局部处理，在不同时间点后摘除，在眼睛表面分别给予二微克的aFGF或TAT- aFGFHis或相同体积的PBS（对照），进行组织融合蛋白的免疫组织化学检测。 PBS对照（图1A），没有His+的细胞（棕色）4个小时后在大鼠经过aFGF-His加药的视网膜上发现，（图 第1B）。然而，His+细胞30分钟后也在经TAT-aFGFHis加药的视网膜上发现。用药后（图1C），TAT-aFGFHis蛋白质主要在发现。该TAT-aFGFHis蛋白质的水平，这是由His+细胞 数量和染色强度决定的，从约30分钟的高峰至1小时，以后逐渐下降，但仍检测到给药后8小时。这些数据表明，TAT- 有能力穿透眼球障碍，而aFGF- His无。局部给药TAT - aFGF- His滴眼液对视网膜缺血再灌注损伤的保护据报道，经颈静脉注射aFGF减少大鼠视网膜IR损伤19。要确定TAT- aFGF蛋白是否具有生物功能，我们评估TAT - aFGF- His在大鼠视网膜IR损伤模型具治疗效果。相对于模拟手术眼（图2A），导致了严重的红外损伤的PBS对照组（图2和3）：第1天，视网膜出现水肿（尤其是内网状层），结果表明，神经节细胞层的视网膜神经节细胞减少，在内核层的分布不均匀，具有致密细胞核的细胞在内核层大量增加;第3天，在内核层水肿的情况有所改善，但视网膜神经节细胞数量依然在减少;第7天，神经节细胞层的视网膜神经节细胞表现出核固缩。类似的病理变化主要出现在给予aFGF- His的视网膜实验组中（图2B和3），这与aFGF- His无法穿透眼球屏障达到视网膜是一致的（图1B）。然而，有效的缺血再灌注损伤保护作用主要出现在TAT - aFGF- His的给药组。从给予TAT - aFGF- His的视网膜可以明显观测到减轻重度病变的治疗变化，包括组织结构更好地维护（图2B）及与PBS或aFGF- His组相比的视网膜神经节细胞的低缩小比例（图3）。此外，TUNEL染色显示，TAT - aFGF- His的治疗也降低了缺血再灌注诱导的视网膜神经节细胞细胞凋亡。从表1和图 4看出，在缺血损伤的第3天和第7天， GCL中，TAT - aFGF- His组的凋亡细胞数相比于PBS组和aFGF- His组均显着少。 视网膜电图进一步明确了视网膜功能。视网膜电图的测量反映整个视网膜的生理条件。在缺血再灌注1天之后，ERG a波，b波的振幅和频率均显着降低（P0.05）（图5和表2）。然而，与PBS或aFGF- His组相比，TAT - aFGF- His组明显有加快愈合的效果。PBS或aFGF- His组都显示出从第一天到第三天的过程中继续降低ERG a波，b波的振幅和频率，而所有这些的ERG测量结果都在缺血再灌注3天后增加。据报道，急性的视网膜缺血会导致b波显著的遗失，相关的a波保存着21。因此，抑制b-波的视网膜电图作为电为减少人类和实验动物视网膜血流量电生理的指标22 23。从第3天到第7天，TAT - aFGF- His组的ERG b波振幅比PBS或aFGF- His组都高的多（图5和表2）。讨论 TAT PTD的构建是很好的，一个基于HIV 1TAT 蛋白的穿膜肽，增强了大分子物质穿透细胞的能力。该机制与包含胞饮和胞吐的途径进入细胞仍然是有争议的 24-26。有报道说，物质与TAT结合可以穿透血脑屏障7，20，27。在本研究中，我们证明了TAT - PTD（TAT49- 57）提供一个潜在的药物输送通道到视网膜。我们注意到，眼球表面经过局部处理后，TAT - aFGF- His能在视网膜中检测到。30分钟后，在视网膜中很容易检测到TAT - aFGF- His 蛋白质，8小时给药后仍然能检测的到。外源aFGF可以减轻体内和体外模型中缺血再灌注损伤28-31。然而，随着aFGF无法穿透眼球屏障（图1B），可以作为无法保护缺血再灌注损伤的对照。从组织和功能分析，aFGF组滴眼液局部滴入眼球表面对视网膜损伤无保护作用（图2和3，表1和2），与此相反，TAT- aFGF- His介导组局部给药后，对视网膜缺血再灌注损伤有强烈的保护作用。这些结果表明，aFGF的生物活性被TAT- aFGF- His的融合蛋白很好的保留了，并且，TAT49- 57在治疗视网膜疾病的过程中是一种高效的药物载体。据报道，aFGF经颈静脉注射也可以改善大鼠视网膜缺血性损伤19。虽然TAT aFGF-His局部给药为非伤害性给药途径提供了一个强有力的手段，但是，比较重要的是需进一步探讨组织/血液分布及对aFGF系统性给药的治疗效果。药物输送到眼睛，在解剖上是一个相对孤立的隔间，存在着挑战。眼的屏障包括角膜，房水和血视网膜屏障。之前的研究结果表明，完整的角膜上皮是TAT融合蛋白穿透屏障的障碍。使用体外角膜培养模型发现，TAT- 半乳糖苷酶不能深层次的穿透角膜上皮细胞，除非上皮细胞被破坏32。类似的结果在我们的研究中发现，在眼球表面局部给药后，TAT - aFGF- His的蛋白只存在于角膜上皮，而不是在血管内皮细胞基质和更深的内皮中（数据未局部管理所示）。尽管需要进一步研究，以确定怎样的TAT - aFGF- His蛋白质能从眼球表面局部运送到视网膜，这些结果表明，他们不太可能通过角膜穿透。 虽然认可的细胞表面TAT受体欠缺，但TAT仍被作为细胞膜脂质双分子层的靶点，因此，其进入细胞有望出现在所有哺乳动物的细胞类型。然而，尽管TAT穿膜肽在很多细胞模型中运用 33，34，但是经观察细胞特异性的存在使TAT融合物进入细胞的机制存在局限性和难穿透性，如高分化上皮细胞35。视网膜细胞中TAT融合物的选择性吸收已有报道，其中TAT融合物为主的吸收在视网膜神经节细胞和一个核层细胞亚型内36，37。我们的研究显示，摄取的TAT - aFGF- His蛋白质也发现主要集中在视网膜神经节细胞。由于局缺缺血损伤是导致视网膜神经节细胞死亡的众多眼部疾病中主要的诱因，选择性aFGF介导到视网膜神经节细胞有可能是提高治疗的出口。图1， TAT aFGF-His，但没有aFGF-His表明局部给药后，融合蛋白穿透视网膜到眼球表面。眼睛10分钟，30分钟，1，2，4和8小时后收集，外用治疗PBS的（A），aFGF-His（B）或TATaFGF-His（C）和组织分布融合蛋白的采用免疫组织化学研。箭头指示代表他的细胞（棕色）。每四只动物各组进行了分析时间点，而代表图片显示。由于从眼睛中的病理表现与PBS和aFGFHis治疗组出现在所有时间点相似，代表数据三个时间点的介绍。区域的规模表示50m)。图2，组织学变化红外视网膜后。大鼠用PBS，2微克aFGF-His或TAT aFGF-His在0天，2和后4视网膜缺血再灌注。眼睛是在1天，第3和第7缺血再灌注后收集，视网膜用苏木精和曙红染色。代表视网膜从假眼程序（A）在实验的第一，二天的眼睛，再灌注后第3和第7（B）所示。五每组动物，以及有代表性的图片显示。区域的规模记50m。图3，TAT - aFGF-His但没有aFGF-His对缺血再灌注保护性减少在视网膜神经节细胞。大鼠分别用PBS的（口），2克aFGF-His（）或TAT- aFGF-His（）