五种抗菌药物对大肠杆菌的体外抗菌效果比较.doc

目录目录中文摘要（关键词）1外文摘要（关键词）2前言31 材料与方法51.1 材料51.1.1 菌株51.1.2 药物51.1.3 培养基及试剂51.1.4 器材51.2 方法51.2.1 培养基的制备51.2.2 大肠杆菌的扩大培养61.2.3 药敏纸片琼脂扩散试验61.2.4 微量稀释法试验71.2.5 棋盘稀释法测定联合抑菌浓度指数（fic）82 结果与分析92.1 药敏纸片琼脂扩散试验92.2 微量稀释法试验102.3 fic 指数113 结论与讨论113.1 讨论113.1.1 关于试验113.1.2 药敏试验在兽医临床疫病防治中的意义123.1.3 药敏试验的注意事项123.1.4 关于耐药性123.2 结论13参考文献15致 谢16沈阳农业大学学士学位论文1摘要摘要细菌耐药性和耐药菌感染是医学界面临的一大难题，目前几乎所有的抗菌药物，均出现了耐药菌株。由于广谱抗菌药的滥用以及细菌间耐药基因的转导等因素，导致耐药菌增多，尤其是大肠杆菌对常用抗菌药物耐药的发展越来越令人担忧。因此，通过纸片扩散法、最小抑菌浓度测定（mic）和联合用药等体外药物敏感试验,比较罗氧氟沙星、庆大霉素、土霉素、磺胺嘧啶钠和氨苄西林钠对大肠杆菌的体外抑菌效果。目的：了解大肠杆菌对常用抗菌药物的耐药情况，指导临床合理用药。方法：通过纸片扩散法、最小抑菌浓度测定（mic）和联合用药等体外药物敏感试验,比较罗氧氟沙星、庆大霉素、土霉素、磺胺嘧啶钠和氨苄西林钠对大肠杆菌的体外抑菌效果。结果：大肠杆菌对氧氟沙星、对庆大霉素和氨苄西林钠敏感；对土霉素耐药；对磺胺嘧啶钠中介。庆大霉素和氧氟沙星联合用药对大肠杆菌呈现协同作用。结论：临床分离的大肠杆菌对常用抗菌药物有耐药性，应根据分离株耐药特点选用不同的治疗方案。关键词关键词：大肠杆菌；药敏试验；mic；fic五种抗菌药物对大肠杆菌的体外抗菌效果比较2abstractbacterial resistance and bacterial infection after bacterial resistance is a big problem in medicine. at present nearly all bacterial are becoming,resistance to their original sensitive antibiotics. drug-resistance bacteria, especially the resistance e. coli, are increasing because of abuse of broad-spectrum antibiotics and transduction of drug resistance gene in bacteria, the drug resistance in e. coli has been caused people much anxiety. for the reason that compare with the ofloxacin、gentamicin、terramycin、sulfadiazine sodium and ampicillin sodium in vitro resistance results about e. coli performed by antimicrobial susceptibility test ,minimal inhibitory concentration (mic) and fic with disc agar diffusion methods.objective: to investigate the resistance of e. coli to commonly used antimicrobial a-gents,so as to guide the rational antimicrobial application in clinic. methods: to compare with the ofloxacin、gentamicin、terramycin、sulfadiazine sodium and ampicillin sodium in vitro resistance results about e. coli performed by antimicrobial susceptibility test ,minimal inhibitory concentration (mic) and fic with disc agar diffusion methods. results showed that e. coli was sensitive to ofloxacin、gentamicin and ampicillin sodium； middle to sulfadiazine sodium；drug sensitive to terramycin. the result suggested that the combination of ofloxacin and the gentamicin demonstrate synergic action on the bacteria. conclusion: e. coli isolated from clinic has multiple resistance to commonly used antimicrobial resistance, different treatment protocols should be chosen according to the drug-resistant characteristics of isolated strains.keywords: e. coli; susceptibility test;mic;fic沈阳农业大学学士学位论文3前言前言致病性大肠杆菌是医学和兽医临床感染中常见致病菌之一23。我国不少地区大肠杆菌在腹泻病人的病原谱中占首位1。在兽医临床上大肠杆菌造成的危害也十分严重,如仔猪黄白痢、猪水肿病、禽大肠杆菌病等一直是困扰养殖业发展的常见病、多发病2。大肠杆菌应激综合症的平均发病率为 30 %40 %,最高达到 80 %,死亡率高达 90 %,在我国由大肠杆菌引起畜禽养殖业的经济损失达数十亿元。2006 年在国内发生的猪高热病疫情中,我们从发病猪场分离出致病性大肠杆菌阳性率占调查猪场的 27 %3。抗生素的应用对控制和预防大肠杆菌所引起的疾病发挥了一定的作用。但随着抗生素的广泛应用,使临床上出现的细菌耐药越来越严重,这已成为世界性问题。严重影响了临床治疗效果给临床治疗带来了很大的困难 4。大肠埃希氏菌( escherichia coli) 通常简称为大肠杆菌，主要寄居于人和动物的肠道内，该菌在自然界分布广泛，属于条件致病菌5 。大肠杆菌属革兰氏阴性兼性厌氧杆菌，对生长条件要求不高，在普通培养基上即能良好生长，无芽孢，有运动能力，可以发酵乳糖、分解葡萄糖。该菌是温血动物肠道后段常在菌，可引起肠道疾病或肠道外感染6。 大肠杆菌病指部分或全部由大肠杆菌所引起的局部或全身性感染的疾病,包括大肠杆菌性败血症、大肠杆菌性肉芽肿、气囊病、禽蜂窝织炎、肿头综合征、腹膜炎、输卵管炎、滑膜炎、全眼球炎和脐炎。大肠杆菌病在哺乳动物中主要引起肠道疾病,而在禽类中,当宿主防御能力下降时,常引起继发性局部或全身性感染。大肠杆菌病给全世界的养禽业造成巨大的经济损失7。氧氟沙星是新的喹诺酮类抗菌素，是抗菌谱广、活性强的杀菌剂，其作用机理是对细菌dna旋转酶具有强力抑制作用，且对细胞壁有高度渗透作用，因此抗菌活性极强8。对大多数革兰阳性菌如金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、链球菌等和革兰阴性菌如大肠杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌、产气杆菌、变形杆菌、流感杆菌、淋球菌等及支原体、衣原体均具有抗菌活性 9，特别是肠道革兰氏阴性菌具有较好的抗菌作用。土霉素抗菌谱与四环素相似，除对革兰氏阳性菌和阴性菌有作用外、对立克次体、衣原体、支原体、放线菌、螺旋体和某些原虫亦有等亦有抑制作用。在革兰氏阳性菌中，对葡萄球菌、溶血性链球菌、炭疽杆菌、破伤风梭菌和梭状芽孢杆菌等作用较强；在革兰氏阴性菌中，对大肠杆菌、沙门氏菌、布鲁氏菌和巴氏杆菌的较敏感。对伤寒杆菌几乎无效，用于痢疾、斑疹伤寒、沙眼、结膜炎、肺炎、中耳炎、疖疮及皮肤化脓感染等。磺胺嘧啶钠抗菌谱广、性质稳定、价格低廉，对许多革兰氏阳性和阴性菌均具抗菌作用。氨苄西林钠为广谱半合成青霉素，对g+ 及g- 均有广谱杀灭作用, 又对耐青霉素的金黄色葡萄球菌有效。对溶血性链球菌、肺炎链球菌和不产青霉素酶葡萄球菌具有较强抗菌作用,与青霉素相仿或稍逊与青霉素10。庆大霉素是一种广谱氨基糖苷类五种抗菌药物对大肠杆菌的体外抗菌效果比较4抗生素，但毒性较大，安全范围窄，对大部分革兰氏阳性和阴性病原菌有效。在阴性菌中，对大肠杆菌、变形杆菌、嗜血杆菌、绿脓杆菌、沙门氏菌和布鲁氏菌等均有较强的作用，特别是对肠道菌及绿脓杆菌有高效。在阳性菌中，对耐药金葡菌的作用最强。对耐药的葡萄球菌、溶血性链球菌、炭疽杆菌等亦有效。近年来，随着临床上应用的抗菌药物的日益增多,特别是许多广谱抗生素及新型抗生素在临床上的广泛应用,使细菌耐药性成为全球关注的焦点。其中肠杆菌属细菌是目前临床感染中最重要的病原菌,对抗生素的耐药性更为显著。细菌的耐药性是普遍存在的,细菌耐药性产生的原因是多方面的,一方面,就细菌本身而言,细菌有显著的适应性和惊人的多变性,除了细菌先天固有的耐药性外,细菌也可以通过接合、转导和转化等方式,由染色体、质粒等介导，产生基因突变,从而使细菌产生获得性耐药。另一方面,就抗生素而言,大量广谱抗生素的广泛应用,特别是第三代头孢菌素的使用,更易筛选出耐药菌株。因此,适当的检测耐药菌株,了解细菌的分布及耐药情况,对防止和延缓细菌耐药性的产生,指导临床医生合理使用抗生素,控制病原菌特别是耐药菌株的播散和流行具有十分重要意义。利用药敏试验来选用抗生素可以指导临床合理用药。药敏试验旨在了解病原微生物对各种抗生素的敏感（或耐受）程度，以指导临床合理选用抗生素药物。其结果一般用敏感、耐药和中介来表示，是提供治疗感染性疾病最有力的依据，也可进行流行病学调查，了解耐药菌株的耐药机制。此外利用药敏谱可对被检菌株进行鉴定。敏感，即被测菌株所引起的感染可以用常用剂量的该抗菌药物治愈，禁忌症除外；耐药，即被测菌株不能被常用剂量所达到的组织内或血液中的抗生素所抑制；中度敏感，表示被测菌株可以通过提高剂量被抑制或在生理性浓集的部位被抑制，抑菌圈落入中介度范围，意义不明确，如果没有其它可以替代的药物，应重复或以稀释法测定mic。本文通过纸片扩散法、mic 测定和联合药敏等试验，测定氧氟沙星、氨苄西林钠、庆大霉素、土霉素和磺胺嘧啶钠五种药物对大肠杆菌的体外抑菌效果并进行比较，为临床合理用药提供依据。沈阳农业大学学士学位论文51 材料与方法材料与方法1.1 材料材料1.1.1 菌株菌株大肠杆菌c81021.1.2 药物药物氧氟沙星：东北制药集团公司沈阳第一制药厂 100 mg/片庆大霉素：河南辅仁怀庆堂制药有限公司 8万单位/2 ml土霉素：药理实验室提供的原粉磺胺嘧啶钠：河南天方药业股份有限公司 2ml:0.4 g氨苄西林钠：上海新亚药业有限公司 1 g/瓶1.1.3 培养基及试剂培养基及试剂营养肉汤：北京奥博星生物技术有限责任公司 规格：250 g营养琼脂：北京奥博星生物技术有限责任公司 规格：250 g氯化钡：沈阳试剂厂 规格：500 g磷酸氢二钾：沈阳化工学试剂厂 规格：500 g磷酸氢二钠：沈阳化工学试剂厂 规格：500 g硫酸：沈阳化工试剂厂 规格：500 ml1.1.4 器材器材冰箱（苏州三星电子 bcd-230njv），数显鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂 gzx-9140mbe），电热恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司 dnp-9082），立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂 ldzx-50kbs），移液枪（上海求精生化试剂仪器有限公司，10-50l,100-500l），超净试验台（苏州净化设备有限公司 sw-cj-2fb）分析天平，移液器枪头，游标卡尺（浙制 0-150 mm）,试管（10 ml），锥形瓶（250 ml），烧杯（100 ml），量筒（100 ml）,移液管（1 ml，2 ml，5 ml），平皿，漏斗，玻璃棒，容量瓶，吸耳球，96孔平板，酒精灯，接种环，镊子，打孔器，研钵，电炉子，脱脂棉，滤纸，胶塞，牛皮纸，绳。1.2 方法方法1.2.1 培养基的制备培养基的制备营养肉汤：用分析天平称取3 g营养肉汤，放入锥形瓶中，加入100 ml蒸馏水，在电炉上加热溶解，盖好胶塞并用牛皮纸包扎瓶口，在121 条件下高压15-20 min。营养琼脂：用分析天平称取4.5 g营养琼脂，放入锥形瓶中，加入100 ml蒸馏水，在电炉上加热沸腾，盖好胶塞并用牛皮纸包扎瓶口，用高压锅在121 c条件下高压1520 min。五种抗菌药物对大肠杆菌的体外抗菌效果比较61.2.2 大肠杆菌的扩大培养大肠杆菌的扩大培养将冰箱内取出的大肠杆菌菌种进行复苏，用接种环取少许菌液，接种于装有肉汤的试管中，在37 c恒温培养箱中培养24 h。用接种环将培养后的菌液在试管斜面上划线，在37 c恒温培养箱中培养24 h。然后放在4 c条件下保存备用。1.2.3 药敏纸片琼脂扩散试验药敏纸片琼脂扩散试验1.2.3.1 含药滤纸片的制备 1.2.3.1.1 纸片的制备。取新华1号定性滤纸，用打孔器打成直径为6 mm的圆形小片。以每瓶100片的数量，放入干洁的青霉素瓶中,用多层报纸包扎瓶口。121 c下高压灭菌1520 min，再置于100 c干燥箱内烘干备用。1.2.3.1.2 试剂的配置11。ph 值6磷酸缓冲液：磷酸氢二钾2 g ,磷酸氢二钠8 g ,蒸馏水1000ml ;ph 值7.8 磷酸盐缓冲液:磷酸氢二钾16.73 g ,磷酸氢二钠0.532 g ,蒸馏水1000 ml ;将上述试剂溶解后,以ph 值计测定酸碱度。高压蒸汽灭菌,121 c 20 min。置于冰箱内保存(最好是现配现用)。1.2.3.1.3 抗菌药液的配置。各种药液浓度及药片浓度见表1。1.2.3.1.4 药敏纸片的制备。分别无菌吸取抗菌药液1 ml ,加入装有纸片的青霉素瓶中,浸泡4560 min ,使得纸片将药液均匀吸净,后取出纸片散开摊于已干热灭菌的空平皿中,无菌室内过夜,待纸片干燥后,盖上橡皮塞,用牛皮纸包好，置于4 冰箱保存备用13。表表1 药敏纸片的制备及含药浓度药敏纸片的制备及含药浓度12,13药物剂型制备方法药液浓度（g/ml）纸片含量（g）庆大霉素注射用针剂2 ml加ph值7.8pb78 ml100010氧氟沙星片剂100 mg加0.1 mol/ml盐酸200 ml5005土霉素药物原粉25 mg加2.0n 盐酸5 ml，加ph值6pb20 ml100010氨苄西林钠注射用粉剂100 mg加ph值6pb100 ml100010磺胺嘧啶钠注射用针剂1 ml加蒸馏水9 ml10000100沈阳农业大学学士学位论文71.2.3.2药敏试验操作步骤 1.2.3.2.1 挑取扩大培养后的大肠杆菌菌落45个,接种于肉汤培养基中,置于37 c培养46 h。1.2.3.2.2 用灭菌生理盐水稀释培养菌液,使其浊度相当于硫酸钡0.5号标准管的浊度(0.5号标准管配制方法:1%-1.5%氯化钡0.5 ml，1%硫酸溶液99.5 ml ,充分混匀,将此液置于肉汤培养基相同的试管中,用前应充分振动)。1.2.3.2.3 用无菌棉拭子蘸取上述肉汤培养液,在试管上挤压,除去多余的液体,用棉拭子涂满琼脂表面,盖好平皿,在室温中干燥5 min ,待平皿表面稍干后再放含药纸片。1.2.3.2.4 用镊子取出含药纸片贴在涂有细菌的平皿培养基表面,一般最多贴7 张纸片,6 张均匀地贴在平皿离边缘15 mm处,一张位于中心,贴纸片时可轻压,以保证与培养基密切接触,倒置于37 c温箱中培养,20 h 取出,观察现象并用游标卡尺测量抑菌圈直径。各种抗菌药物的判定标准，见表 2。表表2 抗菌药物的抑菌环与敏感标准抗菌药物的抑菌环与敏感标准14,15抑菌环的直径（mm）抗菌药物每片含药量（g）耐药中介敏感庆大霉素101213-1415氧氟沙星51213-1516土霉素101011-1415氨苄西林钠101314-1617磺胺嘧啶钠1001213-16171.2.4 微量稀释法试验微量稀释法试验1.2.4.1 药物原液的配置及保存：用分析天平精确称取抗菌药物制剂后，无菌操作溶于相应ph的磷酸盐缓冲液后蒸馏水中，稀释至所需浓度，见表3。表表3 抗菌药物原液的配置抗菌药物原液的配置抗菌药物溶剂药液浓度（g/ml）庆大霉素2 ml加ph值7.8pb60.5 ml1280氧氟沙星100 mg加0.1 mol/ml盐酸78 ml1280土霉素25 mg加2.0n 盐酸5 ml，加ph值6pb14.5 ml1280氨苄西林钠128 mg加ph值6pb100 ml1280磺胺嘧啶钠1 ml加蒸馏水78 ml12801.2.4.2 菌液制备：取经培养的单个菌落1-2个接种于2 ml营养肉汤中，37 c培养1618 五种抗菌药物对大肠杆菌的体外抗菌效果比较8h，使生长浊度达9108个/ml（相当于麦氏比浊管第3管）。比浊方法：取与标准比浊管的口径，厚薄和质料一致的洁净试管，加入适量的待测菌液，将标准比浊管摇匀，手持并列的标准管与待测管，在两管背面衬以印刷字或图片，透过试管目测背景的清晰度。待测管与那一支标准管的浊度相同，即相当于该比浊管的菌数。麦氏比浊管的配置见表4。将达到浊度的菌液用营养肉汤做1：10000稀释。表表4 麦氏比浊管的配置及其浊度单位麦氏比浊管的配置及其浊度单位16管号123456789101%氯化钡溶液（ml）0.10.20.30.40.50.60.70.80.91.01%硫酸（ml）9.99.89.79.69.59.49.39.29.19.0浊度单位（108/ml）369121518212427301.2.4.3 操作步骤：排列有胶塞的无菌试管，每种药物一列，每列为12管。除第一管加入1.6 ml营养肉汤外，其余各管均加1 ml。在第1管中加0.4 ml药液，混匀后吸取1 ml加入第2管中，同法依次稀释至第11管，弃去1 ml。结果第1管中的药物浓度为原液的1/5，第2管为第1管的1/2,依次类推。用移液枪将第1管的药液加入到96孔平板的第1个孔，第2管的药液加入到第2个孔，依次类推，每孔100l。将稀释好的菌液加入到96孔平板中，每孔100l。如此第1孔到第11孔的抗菌药物的最终浓度为128g/ml、64g/ml、32g/ml、16g/ml、8g/ml、4g/ml、2g/ml、1g/ml、0.5g/ml、0.25g/ml、0.125g/ml。第12孔为不含药液的菌液对照。每一药物进行两次平行。并有一排的孔中加200l，作为空白对照。将96孔平板置于垫有湿脱脂棉的托盘内，37 c培养1624 h。观察现象。各种抗菌药物的判定标准，见表5。表表5 抗菌药物的敏感标准抗菌药物的敏感标准17相应的micg/ml抗菌药物耐药敏感庆大霉素84氧氟沙星82土霉素164氨苄西林钠328磺胺嘧啶钠350100沈阳农业大学学士学位论文91.2.5 棋盘稀释法测定联合抑菌浓度指数（棋盘稀释法测定联合抑菌浓度指数（fic）用所选药物的2倍mic浓度做初始浓度，然后分别做二倍稀释的梯度68个。菌液配制方法同1.2.4.1。在无菌试管中配制药液时，第1管内的药液浓度要是所选药物的8倍mic,然后做2倍稀释梯度。用移液枪将第1个试管内的药液50l加入到96孔平板的第一行，第2管的加入到第二排，以此类推.第二种药液是第1个试管内的药液50l加入到96孔平板的第一列，依次类推。并将稀释好的菌液加入到96孔平板中，每孔100l。将96孔平板置于垫有湿脱脂棉的托盘内，于生化培养箱中37 c培养1624 h,观察结果。判断标准：fic指数=甲药联合时的mic/甲药单独时的mic乙药联合时的mic/乙药单独时的micfic指数：0.5为协同作用；0.5-1为累加作用；1-2为无关作用；2为拮抗作用172 结果与分析结果与分析2.1 药敏纸片琼脂扩散试验药敏纸片琼脂扩散试验庆大霉素、氧氟沙星和土霉素均是完全抑菌，在抑菌圈内无菌落生长。其庆大霉素的抑菌圈分别是26.5 mm；25.8 mm；26.2 mm,平均为26.2 mm。氧氟沙星的抑菌圈分别是18.8 mm；18.6 mm；18.4 mm,平均为18.6 mm。土霉素的抑菌圈分别是8.1 mm；8.4 mm；8.2 mm,平均为8.2 mm。氨苄西林钠为部分抑菌，在抑菌圈的中间是8.4 mm的完全抑菌，一点菌没长，外沿长有少数菌落，抑菌圈分别为13.6 mm；13.2 mm；12.8 mm,平均为13.2 mm。磺胺嘧啶钠为部分抑菌，在抑菌圈内都长有菌落，抑菌圈分别为15.6 mm；15.1 mm；15.2 mm,平均为15.3 mm。具体见表5。表表 5 药敏纸片琼脂扩散试验结果药敏纸片琼脂扩散试验结果药名抑菌圈直径（mm）抑菌圈直径（mm）抑菌圈直径（mm）抑菌圈直径平均值（mm）庆大霉素26.525.826.226.2氧氟沙星18.818.618.418.6土霉素8.18.48.28.2氨苄西林钠13.613.212.813.2磺胺嘧啶钠15.615.115.215.3由表2的判定标准得知：大肠杆菌对庆大霉素：敏感；氧氟沙星：敏感；土霉素：耐药；氨苄西林钠：中介；磺胺嘧啶钠：中介。五种抗菌药物对大肠杆菌的体外抗菌效果比较102.2 微量稀释法试验微量稀释法试验表表6 微量稀释法试验结果微量稀释法试验结果管号123456789101112药液浓度（g/ml）12864321684210.50.250.125菌液对照庆大霉素氧氟沙星土霉素氨苄西林钠磺胺嘧啶钠（注：是细菌不生长，孔内澄清；是有细菌生长，孔内混浊。）由表6所示可知庆大霉素的mic值是2g/ml；氧氟沙星的mic值是2g/ml；土霉素的mic值是32g/ml；氨苄西林钠的mic值是8g/ml；磺胺嘧啶钠的mic值是128g/ml。由表5的判定标准可知：大肠杆菌对庆大霉素：敏感；氧氟沙星：敏感；氨苄西林钠：敏感；土霉素：耐药；磺胺嘧啶钠：中介。沈阳农业大学学士学位论文112.3 fic指数指数表表7 棋盘稀释法试验结果棋盘稀释法试验结果庆大霉素(g/ml)药物及浓度4210.50.250.125氧氟沙星单药对照4210.50.25氧氟沙星(g/ml)0.125庆大霉素单药对照（注：是细菌不生长，孔内澄清；是有细菌生长，孔内混浊。）由表7可以看出，庆大霉素在单独抑菌时，是从药液浓度为1g/ml的孔开始长菌，因此单独时的mic值是2g/ml；联合抑菌时，是从药液浓度为0.125g/ml的那列开始长菌的，因此联合时的mic值是0.25g/ml。氧氟沙星在单独抑菌时，是从药液浓度为1g/ml的孔开始长菌，因此单独时的mic值是2g/ml；联合抑菌时，是从药液浓度为0.25g/ml的那行开始长菌的，因此联合时的mic值是0.5g/ml。fic=0.25/2+0.5/2=0.315表明庆大霉素和氧氟沙星具有协同作用。3 结论与讨论结论与讨论3.1 讨论讨论3.1.1 关于试验关于试验药敏试验主要是观察兽医临床用药中抗菌药物抑菌效果的一种检测方法,是基层单位选择药物治疗经常进行的工作之。药敏试验的方法很多,常用的方法有纸片扩散法、肉汤稀释法、琼脂稀释法、etest 法、自动化药敏仪测定等。纸片扩散法是其中最传统的经典方法之一。纸片扩散法是指导临床用药的最简单易行的方法18。本次试验时，完全按试验计划操作并严格无菌操作。配制抗菌药物溶液时选择合适ph的缓冲液对药物的抗菌活力有很大影响，因此缓冲液的选择要准确。配制的缓冲液要用灭菌的蒸馏水并要无菌操作，保证药液不被污染。制作药敏纸片在翻动纸片时要小心不要把纸片戳坏，保证纸片的完整性。贴药敏片时要注意每个药片之间的距离，不要离的过近，五种抗菌药物对大肠杆菌的体外抗菌效果比较12容易影响试验的结果。贴完药敏片后一定要倒置放入温箱内培养。微量稀释法试验操作时，严格进行无菌操作，尽量避免污染的可能性。96孔平板在使用前一定要清洗干净，小孔内不要有杂质或沉淀物，否则容易影响试验结果的观察。并要用75%酒精浸泡过夜，使用时要保证其孔内干燥。菌液和标准比浊管比浊时，标准比浊管一定要摇匀，否则会影响菌液浓度的判定。向小孔内加药液时一定要反复吹吸使其充分混匀。平行试验所得结果比较一致，基本保证试验结果的准确性。本次采取棋盘法进行对大肠杆菌的体外抑菌试验，进行两种药物联合药敏试验，这种方法有其他联合药敏方法所不可比拟的优点，主要在于棋盘法中联合的两种药物的每个药物浓度都有单独和另一个药物的不同浓度的联合，因此能精确测定两种抗菌药物在适当浓度的比例下所产生的相互作用，对联合用药中各药物含量的比例制定有一定的指导作用19。本次试验在体外环境下进行，因此会受到体外的一些因素的影响。影响体外抑茵试验结果的因素很多，如培养基成分、培养基厚度、培养条件、菌液浓度、抗菌药物溶液保存等。因此，要尽量保证培养基、培养温度和观察结果时间一致，以保证实验结果有较好的重复性。并在实验过程中，确保无菌操作，避免受到其它细菌的污染。以确保试验结果的准确性。3.1.2 药敏试验在兽医临床疫病防治中的意义药敏试验在兽医临床疫病防治中的意义合理用药，有效控制疫病。尽快明确致病原，并采取有针对性的治疗措施，是治疗细菌感染性疾病的关键。因而，病原微生物的分离培养和药物敏感试验是非常重要的实验室检查，是制定合适的治疗策略的科学依据。避免抗药菌株的出现，减少养殖成本。目前，抗生素是预防和治疗细菌性传染病的最主要措施，在临床诊疗过程中，利用实验室进行细菌分离、鉴定，以确定致病菌，再用致病菌进行药敏试验，对抗菌药物进行筛选和预测，指导临床用药，是最合理的预防和治疗细菌性疫病的方法。从而，避免了抗生素的滥用，做到有的放矢，降低菌株对抗生素的选择压力，减少养殖成本。进行耐药监测及流行病学调查。利用药物敏感试验进行耐药监测及流行病学调查，可以为动物疫病预防与控制部门提供防治依据，有效的控制区域性的细菌性疫病的发生，控制抗菌药物的不规范使用，延长新药的使用寿命。另外，药敏试验还可为新药的研究和评估提供有价值的信息。因此，药物敏感试验在细菌性疾病的防治方面具有日益重要的实际意义20。3.1.3 药敏试验的注意事项药敏试验的注意事项一些抑菌性药物的抑菌圈外围常不会显示完全抑制面而产生不明显生长，也要以外围界限进行测量。若抑菌圈内存有清晰的菌落，则该菌落可能为抗药性变种或其他不同细菌，如果证实该菌落为抗药性变种，即使有很大的抑菌环，也视为抗药21。实际操作中有时会出现药敏试验结果与临床治疗结果不符，最常见的原因是分离沈阳农业大学学士学位论文13的细菌不是真正的致病菌，而对一些营养苛求的致病菌也易出现这种误诊。所以通过流行病学调查、病理检验以及实验室检查做出综合判定后，再进行药敏试验是非常必要的。3.1.4 关于耐药性关于耐药性3.1.4.1 耐药机制细菌主要通过以下几种方式抵制抗菌药物作用: 产生灭活酶,使抗菌药物失活或结构改变。细菌产生的灭活酶主有水解酶和钝化酶两大类。水解酶可破坏药物使之失效,如内酰胺酶可水解青霉素或头孢菌素的内酰胺环而使药物失效。这类酶可由染色体或质粒介导。钝化酶又称合成酶,它们多数为革兰阴性菌所产生的氨基糖苷类抗生素的钝化酶。该酶可修饰抗菌药物分子中某些保持抗菌活性所必需的基因,使其与作用靶位核糖体的亲和力大为降低,从而失去其抑制细菌蛋白质合成的作用。改变细菌细胞壁的通透性,使抗菌药物不能进入菌体内。细菌体内抗菌药物作用的靶位结构改变,使之不能与抗菌药物结合。抗生素对细菌作用靶位的改变是细菌获得抗药性的又一途径。抗生素通过作用于特异性的必要细胞组成部分抑制细菌生长繁殖。此组成部分的变化可阻止药物的结合和作用,因而使细菌对药物产生抗药性。如由质粒介导的对林可霉素和红霉素的抗药性,系细菌核蛋白体23 s 亚基上腺嘌呤甲基化,使药物不能与细菌结合所致。形成代谢拮抗剂与药物争夺靶酶。细菌可通过代谢拮抗剂产量的增加来抑制抗菌药物的作用。如金黄色葡萄球菌与磺胺类药物多次接触后,对氨苯甲酸产量可增加至原敏感菌产量的20100倍,后者与磺胺药竞争二氢叶酸合成酶,使磺胺药的作用下降甚至消失。通过主动外排作用,将药物排出菌体外。细菌分泌细胞外多糖蛋白复合物将自身包绕形成细菌生物被膜。细菌形成生物被膜后,往往对抗菌药物产生高度耐药性,其原因有:a.细菌生物被膜可减少抗菌药物渗透; b.吸附抗菌药物钝化酶,促进抗菌药物水解;c.细菌生物被膜下细菌代谢低下,对抗菌药物不敏感。3.1.4.2 对细菌耐药性采取的对策针对细菌耐药性产生的原因和机制,应采取以下对策: 加强对抗菌药物的研究,开发新的作用机制的抗菌药物。针对耐药机制合理选择抗菌药物不当的抗菌药物对细菌产生筛选作用,使耐药菌株有更好的生存环境,导致耐药菌株的流行。因此应针对致病源,合理选择抗菌药物,制定个体化给药方案。以回复突变为理论依据,循环使用抗菌药物在选择药物方面,以回复突变为理论依据的循环使用抗菌药物的方法值得推荐。加强医药市场管理,打击假药、劣药。加强消毒、隔离制度,防止耐药菌的交叉感染。加强对医师和药剂师的教育。另外医生和药剂师还应教育患者合理使用抗菌药物,坚持按医嘱治疗。3.2 结论结论本试验结果表明，大肠杆菌对氧氟沙星、庆大霉素和氨苄西林钠敏感，对土霉素耐药，对磺胺嘧啶钠中介。氧氟沙星和庆大霉素联合用药对大肠杆菌协同。五种抗菌药物对大肠杆菌的体外抗菌效果比较14耐药性的出现可能与菌株长期处于多种抗生素选择压的环境中，其耐药基因通过染色体或耐药质粒在菌群问的广泛传播或扩散有关22，这些给我们临床用药带来很大的困难。通过本试验表明对大肠杆菌所引起的疾病的治疗上应尽量选用氧氟沙星、庆大霉素、氨苄西林钠等敏感性较高的药物，少用土霉素、磺胺嘧啶钠等耐药程度较高的药物。同时，在选择抗菌药物上最好考虑采取联合用药、交叉用药、轮换用药的方式，一方面可以充分发挥抗菌药物之间的协同作用，增加疗效；另一方面可以避免因细菌长期与某一种药物接触而增强耐药性。正确利