电泳技术和常用电泳仪(PPT-48).ppt

第六章 电泳技术和常用电泳仪 第六章 电泳技术和常用电泳 仪 一、概述 generalization) 电泳（electrophoresis）是指带电荷的溶质 或粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电 极移动的现象。利用电泳现象将多组分物质分离 、分析的技术叫做电泳技术（electrophoresis technique）。可以实现电泳分离技术的仪器称 之为电泳仪（electrophoresister）。 第六章 电泳技术和常用电泳仪 目前，电泳技术已广泛用于蛋白质、多肽 、氨基酸、核苷酸、无机离子等成份的分离和 鉴定，甚至还用于细胞与病毒的研究。 临床常用的电泳分析方法主要有醋酸纤维 素薄膜电泳、凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向 电泳和毛细管电泳等。 第一节 电泳原理 一、电泳的基本原理 物质分子在正常情况下一般不带电，即所带正负 电荷量相 等，故不显示带电性。但是在一定的物理作用 或化学反应条件下，某些物质分子会成为带电的离子（或 粒子），不同的物质，由于其带电性质、颗粒形状和大小 不同，因而在一定的电场 中它们的移动方向和移 动速度也不同，因此可 使它们分离。 06-01电泳现象和电渗流现象。 第一节 电泳原理 若将带净电荷Q的粒子放入电场，则该粒子所 受到的电荷引力为： F引=E Q （6-1） 在溶液中,运动粒子与溶液之间存在阻力F阻 F阻=6rV （6-2） 当F引=F阻时 EQ= 6rV V = EQ/6r （6-3） 由上式可以看出,粒子的移动速度(泳动速度V) 与电场强度(E)和粒子所带电荷量(Q)成正比,而与粒 子的半径(r)及溶液的粘度()成反比。 第一节 电泳原理 二、影响电泳的外界因素 （一）电场强度 （二）溶液的pH值 （三）溶液的离子强度 （四）电渗作用 （五）粒子的迁移率 （六）吸附作用 第二节 常用电泳技术和电泳方法 一、电泳技术的分类 （一）根据工作原理的不同：可分为移界电泳 、区带电泳、等速电泳、等电聚焦电泳、免疫 电泳等。 （二）根据有无固体支持物可分为：自由电泳 和支持物电泳 第二节 常用电泳技术和电泳方法 （三）根据支持载体的位置或形状可分成：水平电 泳、垂直电泳、板状电泳、柱状电泳、U型管电 泳、倒V字形电泳、毛细管电泳等。 （四）根据支持物的特点又可分为： 无阻滞支持物电泳。高密度的凝胶电泳 。 （五）根据电源控制的不同，一般可分为以下3类 ： 1. 恒压电泳; 2. 恒流电泳; 3. 恒功率电泳 。 第二节 常用电泳技术和电泳方法 （六）根据自动化程度的不同，可分为半自动和 全自动型。 （七）根据其功能的不同，可分为制备型、分析 型、转移型、浓缩型等。 （八）根据用法的类型可分为：双向电泳、交叉 电泳、连续纸电泳、电泳层析相结合技术等。 （九）根据不同的使用目的可分为：核酸电泳、 血清蛋白电泳、制备电泳、DNA测序电泳等。 第二节 常用电泳技术和电泳方法 二、电泳方法简介 （一）纸电泳 指用滤纸作为支持载体的电泳方法 。是最早使用的区带电泳。 06-02 平卧式电泳槽装置示意图 将滤纸条水平地架设在 两个装有缓冲溶液的容器之 间，样品点于滤纸中央。当 滤纸条被缓冲液润湿后，再 盖上绝缘密封罩，即可由电 泳电源输入直流电压（100V 1000V）进行电泳。 第二节 常用电泳技术和电泳方法 （二）醋酸纤维素薄膜电泳 电泳时经过膜的预处理、加样、电泳、染色 、脱色与透明即可得到满意的分离效果。此电泳的 特点是分离速度快、 电泳时间短、样品 用量少。因此特别 适合于病理情况下 微量异常蛋白的检测。 06-03 血清蛋白的电泳图谱 第二节 常用电泳技术和电泳方法 （三）凝胶电泳 由区带电泳中派生出一种用凝胶物质作支持物进行 电泳的方式，被称为凝胶电泳。普通的凝胶电泳在板上 进行，以凝胶作为介质。电泳中常用的凝胶为葡聚糖、 交联聚丙烯酰胺和琼脂糖。 它具有机械强度好、弹性大、 透明、化学稳定性高、无电渗 作用、设备简单、样品量小 (1100g）、分辨率高等优点。 06-04 凝胶电泳图 第二节 常用电泳技术和电泳方法 （四）等电聚焦电泳 1 等电聚焦电泳过程 一种利用有pH值梯度的 介质，分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。 将等电点不同的蛋白质混合 物加入有pH值梯度的凝胶介质中 ，在电场内经过一段时间后，各 组分将分别聚焦在各自等电点相 应的pH值位置上，最后，样品的 各组分在各自的等电点聚焦成一 条清晰而稳定的窄带。 06-05 净电荷与PH的关系曲线 第二节 常用电泳技术和电泳方法 2等电聚焦电泳的特点 使用两性载体电解质，在电极之间形成 稳定、连续、线性的pH梯度；由于“聚焦效应 ”，即使很小的样品也能获得清晰、鲜明的区带 界面；电泳速度快;分辨率高;加入样品的 位置可任意选择；可用于测定蛋白质类物质的 等电点;适用于中、大分子量（如蛋白质、肽类 、同工酶等）生物组分的分离分析。 第二节 常用电泳技术和电泳方法 （五）等速电泳 采用两种不同浓度的电解质组 成，一种为前导电解质，充满整个毛细管柱； 另一种为尾随电解质，置于一端的电泳槽中。 前导电解质的迁移率高于任何样品组分，后者 则低于任何样品组分，被分离的组分按其不同 的迁移率夹在中间，在强电场的作用下，各被 分离组分在前导电解质与尾随电解 质之间的空隙中移动， 实现分离。 06-06 等速电泳示意图 第二节 常用电泳技术和电泳方法 （六）双向凝胶电泳（二维电泳） 第一向采用等电聚焦 根据复杂的蛋白质 成分中各个蛋白质的PI的不同，将蛋白质进行 分离。 第二向采用了十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰 胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）就是按蛋白质分子 量的大小使其在垂直方向进行分离。其结果不 再是条带状，而是呈现为斑点状 。 第二节 常用电泳技术和电泳方法 胶性 PH9 中电 加解 入质 了溶 双液 PH3 加上电 场后建 立稳定 PH梯度 蛋白质 溶液加 入，建 立电场 染色后，蛋 白质因PI值 不同，沿PH 梯度分离开 第一向 等电聚焦 PI 逐 渐 降 低 等电聚焦胶放在SDS 聚丙烯酰胺凝胶上 第二向 SDS聚丙 烯酰胺凝胶 电泳 分子 量逐 渐降 低 PI 逐渐降低 06-07 双向凝胶电泳示意图 第二节 常用电泳技术和电泳方法 (七）免 (疫)(役)电泳 免疫电泳是琼脂平板电泳和双相免疫扩散两 种方法的结合。将抗原样品在琼脂平板上先进行电 泳，使其中的各种成分因电泳迁移率的不同而彼此 分开，然后加入抗体做双相免疫扩散，把已分离的 各抗原成分与抗体在琼脂中扩散而相遇，在二者比 例适当的地方，形成肉眼可见的沉淀弧。 第三节 常用电泳设备的基本结构及技 术指标 一、常用电泳设备的基本结构 （一）电泳电源 （二）电泳槽 （三）附加装置 06-08 平卧式电泳槽装置示意图 第三节 常用电泳设备的基本结构及技 术指标 二、电泳仪的主要技术指标 1 输出电压 8 连续工作时间 2 输出电流 9 保护措施 3 输出功率 10 显示方式 4 电压稳定度 11 定时方式 5 电流稳定度 12 电源电压 6 功率稳定度 13 电源频率 7 输出组数 14 功耗 第四节 毛细管电泳的基本结构和分离 模式 一、毛细管电泳的相关概念 1. 电场强度 （Electric Field Strength） 2. 电泳淌度 ( Electrophoretic Mobility) 3. 迁移时间 （Migration Time） 4. 电泳速度 ( Electrophoretic Velocity) 5. 电渗流 （Electroosmotic Flow，EOF） 6. 焦耳热 （Joule Heating） 第四节 毛细管电泳的基本结构和分 离模式 二、毛细管电泳的基本工作原理 溶液中的带电粒子以高压电场为驱动力 ，沿毛细管通道，以不同速度向与其所带电荷相 反的电极方向迁移，并依据样品中各组分之间淌 度和分配行为上的差异 而实现分离。 第四节 毛细管电泳的基本结构和分 离模式 06-09 毛细管电泳仪装置示 意图 第四节 毛细管电泳的基本结构和分 离模式 三、毛细管电泳的特点 1. 高灵敏度 2. 高速度 3. 高分辨 率 4. 样品少 5. 自动化程度高 6. 应用范围广 06-10 英特雷勃 全自动电泳仪 第四节 毛细管电泳的基本结构和分 离模式 四、毛细管电泳的分离模式 （一）毛细管区带电泳 它是通过在充满电解质溶液的毛细管中，不同质荷 比大小的组分在电场的作用下，依迁移速度的不同而进 行分离的。根据组分的迁移时间 进行定性，根据电泳峰 的峰面积或峰高进行定 量分析。 06-11 毛细血管区带电泳原理图 第四节 毛细管电泳的基本结构和分 离模式 （二）毛细管凝胶电泳 将板上的凝胶移到毛细管中作支持物进行的电 泳。凝胶具有多孔性，起类似分子筛的作用， 能根据待测组分的质荷比和分子体积的不同而 进行分离。 适用于分离、测定肽类、蛋白质、DNA类物质 的分离。 第四节 毛细管电泳的基本结构和分 离模式 （三）毛细管胶束电动色谱(MECC) 使MECC系统中存在两个相：流动的水相 和起到固定相作用的胶束相。在含有胶束的流 动相中，溶质在“水相”和“胶束相”(准固定相)之 间进行分配，即使是中性溶质，因其本身疏水 性不同，在二者之间的分 配也会有差异，疏水 性强的溶质在“胶束相”中停留时间长，迁移速 度就慢。反之，亲水性强的溶质迁移速度就快 ，最终中性溶质将依其疏水性不同而得以分离 。 第四节 毛细管电泳的基本结构和分 离模式 06-12毛细管胶束电动色谱原理图 第四节 毛细管电泳的基本结构和分 离模式 （四）毛细管等电聚焦电泳 不同等电点的分子分别聚集在不同的位置 上，不作迁移而彼此分离，这就是等电聚焦分 离过程。毛细管的等电聚焦是在毛细管内实现 的等电聚焦过程，具有极高的分辨率，通常可 以分离等电点差异小于 0.01pH单位的两种蛋白 质，例如肽类、蛋白质的分离。 第四节 毛细管电泳的基本结构和分 离模式 （五）毛细管等速电泳 毛细管内首先导入具有比被分离各组分高 电泳淌度的前导电解质，然后进样，随后再导 入比各分离组份低电泳淌度的尾随电解质，在 强电场的作用下，各被分离组分在前导电解质 与尾随电解质之间的空隙中发生分离。 第四节 毛细管电泳的基本结构和分 离模式 （六）毛细管电色谱 它包含了电泳和色谱两种机制，是在毛细管中填 充 或在毛细管壁 上键合（或涂壁）固 定相，从而构成毛细 管色谱柱，依靠电渗 流推动流动相，携带 样品迁移，根据样品 分子的质荷比、分子 尺寸及分配系数的差 别而分离。 06-13 CEC-加压毛细管电色谱仪 第四节 毛细管电泳的基本结构和分 离模式 五、毛细管电泳仪的基本结构 毛细管电泳仪的结构并不复杂，主要有高压 源、毛细管柱、检测器，以及两 个供毛细管两端插入而又可 和电源相连的缓冲液槽。 （一）毛细管柱 （二）检测器 （三）毛细管电泳 法的进样技术 06-14毛细管电泳仪 第四节 毛细管电泳的基本结构和分 离模式 六、常用各种电泳仪简介 （一）稳压稳流电泳仪 稳压稳流电泳仪是中压电泳仪。其输出电压 的调节范围为0V600V、输出电流为0mA100mA 。该机工作稳定性好、调节范围宽，并设有完善 的短路保护电路和过流保护电路，是目前国内中 、低压电泳实验中应用最广泛的电泳仪之一。 06-15 稳压稳流电泳仪 第四节 毛细管电泳的基本结构和分 离模式 （二）全自动醋纤膜电泳仪 全自动醋纤膜电泳仪为全自动电泳仪，有 可见光单系统，使用醋酸纤维薄膜电泳片，优 点为自动化程度高。只需将样品、试剂、电泳 片放好，人员可离机完成实验并得到结果。 第四节 毛细管电泳的基本结构和分 离模式 （三）全自动荧光/可见光双系统电泳仪 全自动荧光/可见光双系统电泳仪为全自动电 泳仪，具有荧光/可见光双系统，在使用荧光试 剂项目如CK、LD同工酶时为全自动。只需将 样品、试剂、琼脂糖凝胶电泳胶片放好后，操 作人员可离机完成实验并得到结果。 第四节 毛细管电泳的基本结构和分 离模式 （四）全自动琼脂糖电泳仪 全自动电泳仪，有可见光单系统，使用琼脂 糖凝胶电泳胶片，优点为灵敏度高，可适用于 低浓度蛋白检验 。该仪器自动化程度较差， 当电泳结束和染色脱色完成后，工作人员必须 将电泳片由机器中取出。 第四节 毛细管电泳的基本结构和分 离模式 （五）双向电泳及双向电泳-液相色谱-质谱联用 双向电泳是将样品进行电泳后，在它的直 角方向再进行一次电泳。双向电泳第一向为等 电聚焦，第二向为梯度SDS电泳。样品经过电荷 与质量两次分离后可得到分子的等电点、分子 量等信息。这是目前所有电泳技术中分辨率最 高，信息量最多的技术，已成为分析复杂蛋白 混合物的基本工具。 第四节 毛细管电泳的基本结构和分 离模式 （六）高效毛细管电泳及高效毛细管电泳-质谱 联用 高效毛细管电泳是以弹性石英毛细管为分 离通道，以高压直流电场为推动力，依据样品 中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现 分离的电泳分离分析方法。高效毛细管电泳是 一种迅速发展的分离技术，仪器简单、操作简 便、分析速度快、分离效率高、操作模式多、 开发分析方法容易、实验成本低、消耗少、应 用范围极广。 第四节 毛细管电泳的基本结构和分 离模式 （七）毛细管电泳芯片 利用毛细管电泳芯片可以进行DNA长度分 析、序列分析和基因分型等研究。是利用芯片 分离荧光标记的寡核苷酸，整个分离过程在 45s之内，而芯片的长度仅为3.8cm。因为其 可承载高电压（2300V/cm）并具有较小的样 品体积，故有利于得到较好的分离效果。 第四节 毛细管电泳的基本结构和分 离模式 （八）DNA测序系统 该系统利用凝胶毛细管的原理，将多道毛细管 阵列设计，用四种不同的荧光染色标记4种核 苷酸，在模板上合成DNA单链，然后在DNA外切 酶的作用下进行碱基的连续水解和释放，用激 光识别和记录释放的碱基。 06-16 DNA测序系统 第五节 电泳仪的临床应用 一、 血清蛋白电泳 新鲜血清经醋酸纤维薄膜或琼脂糖电泳、染 色后，通常可见5条带，即清蛋白、1、2、和球 蛋白。许多疾病总血清蛋白浓度和各蛋白组分的比 例有所改变，通过血清蛋白电泳图谱能帮助我们对 某些疾病进行诊断及鉴别诊断。 06-17 血清蛋白电泳图谱 第五节 电泳仪的临床应用 二、尿蛋白电泳 临床进行尿蛋白电泳的主要目的是：确 定尿蛋白的来源；了解肾脏病变的严重程度 （选择性蛋白尿与非选