圆二色光谱原理及在药化中的应用(1)-教案.ppt

手性光谱学原理 及在药化中的应用 北京协和医学院 药物研究所 圆二色谱实验室 2011年9月16日 1 什么是手性光谱学（Chiroptic/chiroptical Spectroscopy）？ 2 Chiroptic/chiroptical: A term referring to the optical techniques (using refraction, absorption or emission of anisotropic radiation) for investigating chiral substances e.g. measurements of optical rotation at a fixed wavelength, optical rotatory dispersion (ORD), circular dichroism (CD), and circular polarization of luminescence (CPL). 3 手性化合物的绝对构型确定（Absolute configuration assignment）和构象分析（Conformation analysis） 生物大分子的结构和功能研究 材料科学 。 手性光谱学能解决什么问题？ 4 手性是自然界的普遍现象。天然产物、合成药物、生物 大分子（蛋白质、核酸、糖）大多具有手性。 为什么要进行手性光谱学研究？ 紫杉醇 五味子丙素 5 立体化学 手性药物 紫外光谱 分子性质 偏振光 一、基础知识 6 基础知识 光学活性（又称为手性，chirality）是指化学分子 的实物与其镜像不能重叠的现象。 COOH NH2 CH3 H Chiral L-alanine COOH CH3 NH2 H D-alanine 7 7 基础知识 分子的手性是由于分子中含有手性中心（Chiral center）、 手性轴轴（Chiral axis）或手性面（Chiral plane）所致，非平面 环环状化合物则则具有螺旋手性（Spiral chirality）。 手性四面体手性碳 手性硫手性叔胺 8 环芳香类手性平面螺旋手性 取代丙二烯类 手性轴 取代联苯手性轴 基础知识 9 基础知识 在空间上不能重叠，互为镜像关系的立体异构体称为对映异构体。 非对映异构体包括几何异构体和具有光学活性但没有镜像关系的立体异构体 。 立体异构体（Stereoisomer）是指由分子中原子在空间上排 列方式不同所产生的异构体，可分为对映异构体（Enantiomer）和 非对映异构体（Diastereomer, diastereoisomer）两大类。 （）-赤藓糖 （+）-赤藓糖（）-苏糖（+）-苏糖 10 基础知识 构象（Conformation）：由于分子中的某个原子（基团）绕C-C单键 自由旋转而形成的不同的暂时的易变的空间结构形式，不同的构象之间可以 相互转变。在各种构象中，势能最低、最稳定的构象是优势构象。 单键旋转引起 环的扭曲方向不同引起 11 基础知识 构型（Configuration）：因分子中存在不对称元素而产生的异 构体中的原子或取代基团的空间排列关系。 能真实描述手性分子中各取代基的空间排列情况被称为绝对构型 （Absolute Configuration）。尚未能确定各取代基空间排列真实 情况的构型被称为相对构型（Relative Configuration）。相对构 型还包括同分子中各不对称碳原子间的相互关系，如同侧或异侧。 相对构型的表示方法绝对构型的表示方法 绝对构型的表示方法 左旋体（Levorotatory）和右旋体（Dextrotatory） 12 基础知识 能使偏振光的偏振面按顺时针顺时针 方向旋转转的对对映体称为为右旋体 ，用d-或(+)-表示；反之，称为为左旋体，用l-或(-)-表示。 外消旋体（Racemate）由等量的左旋体和右旋体构成，没有 旋光性，用dl-或()-表示。 这这种表示方法，直观观地反映了对对映体之间间光学活性的差别别， 但不能提供手性分子三维维空间间排列或绝对绝对 构型的信息。 以标准参照物的化学相关性确定药物的立体化学构型。 标准参照物有糖类如D-甘油醛，氨基酸如L-丝氨酸。 13 基础知识 D和L系统 由于D/L构型表示法与表示旋光方向的d和l系统统容易混淆， 且意义义不甚明确，目前多限于糖和氨基酸的立体化学命名。 将手性中心的取代基按原子序数依次排列，A B C D，把D 作为手性碳原子的顶端，A、B、C为四面体底部的3个角，从底部向 顶端方向看，若保持从大到小基团按顺时针方向排列者，称为R型； 若为逆时针方向排列者，称为S型。 14 基础知识 R和S系统 15 对映体在对称的环境中，物理化学性质完全相同。但在非对称 的环境中，例如在偏振光中，对映体对偏振光面旋转方向相反；在 生物系统中与酶或受体相互作用时，由于蛋白质分子的非对称性， 与对映体的识别方向和结合位点不同，导致生物活性的差异。 非对映体之间，彼此属于不同结构的化合物，所以物理化学和 生物学性质均不相同。 基础知识 16 临临床药药物 1850种 天然和半 合成药药物 523种 化学合成 药药物 1327种 非手性6种 手性517种 非手性799种 手性528种 以单单个对对映 体给药给药 509种 以外消旋体 给药给药 8种 以单单个对对映 体给药给药 61种 以外消旋体 给药给药 467种 基础知识 17 基础知识 在分子水平上，生物系统是由生物大分子组成的手性环境。 光学异构体进入生物体内，将被手性环境识别为不同的分子，从 而表现出不同的药效学、药物动力学、毒理学行为。 各国药政部门规定在申报手性新药时，需同时呈报各光学异构体 的药理学、毒理学、药物动力学资料。如果对映体之间的药效与 毒性无明显区别，才可考虑应用外消旋体，否则必须应用单一的 手性化合物。 我国药品管理法已明确规定，对手性药物必须研究光学纯异构体 的药代、药效和毒理学性质，择优进行临床研究和批准上市。停 留在外消旋体药物的研究与开发水平，已不符合国际与国内药品 法规的要求。 18 基础知识 u对映体有相同的药理活性 R和S型异构体的抗心率失常和对心肌钠通道作用相同，吸收、 分布、代谢、排泄性质亦无显著区别，两者及外消旋体的综合评价 结果相当，所以临床使用消旋的氟卡尼。 19 u对映体活性类型相同但强度不同 基础知识 S-(-)-氧氟沙星抑制细细菌拓 扑异构酶II的活性是R-(+)-型的 9.3倍，是外消旋体的1.3倍。对对 各种细细菌的抑菌活性S型强于R 型8128倍。左氧氟沙星已取 代消旋氧氟沙星。 S-(+)-萘萘普生的抗炎和 解热镇热镇 痛活性约为约为 R-(-)-型 的1020倍，因此，临临床 用其S-(+)-对对映体。 20 基础知识 u只有一个对映体有药理活性 (+)-联苯双酯(-)-联苯双酯 由于联联苯基存在阻转转作用，形成两个阻转转异构体，室温下 可稳稳定存在。右旋体为为活性体。 21 基础知识 u对映体有不同或相反的药理活性 左旋咪唑唑（Levamisole） 有驱驱虫和免疫刺激作用，而右 旋咪唑唑（Dextramisole）有抗 抑郁作用。 奎宁-奎尼丁（Quinine- Quinidine）两个异构体都有抗 疟疟、解热热、氧化毒性和骨骼肌 及心肌抑制作用。奎宁主要用 于解热热和抗疟疟，奎尼丁对对心肌 作用更强，用于心房纤颤纤颤 和其 他心律不齐齐。 22 基础知识 在20世纪60年代出现的沙立 度胺事件是药学史上的沉痛教训 。 S-(-)-沙立度胺的二酰亚胺进行酶 促水解，生成邻苯二甲酰亚胺基戊二酸 ，后者可渗入胎盘，干扰胎儿的谷氨酸 类物质转变为叶酸的生化反应，从而干 扰胎儿发育，造成畸胎。 23 基础知识 偶极矩（Dipole moment）是正、负电负电 荷中心间间的距离r和 电电荷中心所带电带电 量q的乘积积， = r q。它是一个矢量，方向规规 定为为从负电负电 荷中心指向正电电荷中心。偶极矩的单单位是D（德拜） 。 偶极矩可以指键键偶极矩，也可以是分子偶极矩。分子偶极矩 可由键键偶极矩经经矢量加法后得到。实验测实验测 得的偶极矩可以用来判 断分子的空间间构型。 偶极矩 24 生色团和助色团 基础知识 生色团团（Chromophoric group）是指分子中含有的，能对对 光辐辐射产产生吸收、具有跃跃迁的不饱饱和基团团。通常表现为现为 n*和 *跃跃迁，因而吸收范围围多在200800nm之间间。 助色团团（Auxochrome group）是含孤对电对电 子的基团团，如氨 基、羟羟基和卤卤素等。这这些基团团与生色团团上的不饱饱和键键作用，使 颜颜色加深。 25 基础知识 u 光是一种电磁波横波 机械波穿过狭缝 26 u 平面偏振光（又称线偏振光） 基础知识 17世纪，Huggens，发现偏振光； 1812年，Biot，发现石英能使偏振光的偏振面旋转； 1934年，Lowry，旋光测定； 1953年，制备了第一台偏振光检测仪； 19世纪60年代以后，圆二色谱仪出现。 自然光-光振动沿各个方向均匀分布 偏振光-光振动沿着特定的方向 27 基础知识 当只有一块偏振片时，以 光的传播方向为轴旋转偏振片 ，透射光的强度不变。 当两块偏振片的透振方向 平行时，透射光的强度最大， 但比通过一块偏振片时弱。 当两块偏振片的透振方向 垂直时，透射光的强度最弱， 几乎为零。 28 基础知识 偏振光的应用：立体电影 两个摄像机 + 偏振片 两个放像机 + 偏振片 眼睛 + 偏振片 29 基础知识 u 左旋圆偏振光和右旋圆偏振光 振幅相同、周期相同， 但运动方向相反 二、旋光光谱与圆二色谱测定原理 30 比旋光度 旋光光谱 圆二色谱 Cotton效应 平面偏振光在手性环境中的传播特性 使平面偏振光的偏振平面发生偏转 反映了手性化合物的圆双折射性 (1) 左旋、右旋圆圆偏振光的折射率不同 nL nR 31 ORD & CD原理 式中，是波长，nL和nR分别为左旋圆偏振光和右旋圆偏振光 在介质中的折射率，的单位是rad/cm，的单位是/dm。 32 偏振平面所转过转过 的角度可用下式计计算： ORD & CD原理 = (/)(nL nR) = 1800/ = (1800/)(nL nR) 将的单单位由rad转变为转变为 ，即实验实验 测测定的旋转转角度为为： 33 (2) 左旋、右旋圆圆偏振光的吸收系数不同 L R 形成椭圆偏振光 反映了手性化合物的圆二色性 ORD & CD原理 形成具有一定偏转角度的椭 圆偏振光 34 ORD & CD原理 (3) 左旋、右旋圆圆偏振光的折射率和吸收系数均不同 nL nR，L R 35 圆圆二色性是摩尔吸收系数的差值值，在手性介质质中， ORD & CD原理 = L R 0 椭圆椭圆 度（）定义为义为 ： tan = tanh(/)(L R)lcm) 式中是吸收指数，l是光程长长度，单单位是/cm。 吸收指数与消光系数k的关系为为 ： 由于(L R)lcm 1，可近似为为： = (/)(L R) k = (4/) 吸收系数之差(L R)通常只是的10-2到10-4。 36 将椭圆椭圆 度的单单位由rad转变为转变为 ，换换算公式如下： = (1800/)(L R) = (1800/4)(kL kR) 摩尔椭圆椭圆 度的计计算公式如下： = (/cl)(M/100) 由于消光系数k = 2.303c，摩尔椭圆椭圆 度的计计算公式如下： = 2.303(4500/)(L R) = 3300() ORD & CD原理 37 比旋光度测定 仪仪器记录记录 的是旋光率，计计算公式为为： D = /(lc) D 比旋光度，D: 589 nm l:池长长，dm c: 溶液浓浓度，g/mL 常用光源： 钠钠灯（589nm） 汞灯（365nm、436nm、 546nm、578nm） 比旋光度（Specific optical rotatory ） D17 = + 213 0.3 （c= 5.77, 氯仿） 38 注意： 一个手性化合物的比旋光度随测测定温度、浓浓度、溶剂剂而变变化， 因此测测定时应时应 当注意选择选择 与文献报报告相同或相近的温度、相同 的溶剂剂，以及配置相近浓浓度的溶液，否则难则难 以比较较。 比旋光度的符号与该该分子的绝对绝对 构型没有直接关系。 比旋光度报告形式： 比旋光度测定 旋光测定的应用 1.确定样品的光学纯度，用于工业生产过程对产品质量的检测。 2.确定手性分子的绝对构型（某些类化合物已总结出一些经验性 的结构与旋光性的关系规则）。 3.测定不对称合成中的某种产物的光学纯度百分率或对映体过量 百分率。 39 光学纯纯度百分率(%O.P.) = 观 观察 / 最大 X 100% 对对映体过过量百分率(%e.e.) = (R - S) / (R + S) X 100 % = %R - %S 比旋光度测定 旋光光谱（Optical rotatory dispersion，ORD） 40 ORD图谱测定 以比旋光度或摩尔旋光度为纵为纵 坐标标，以波长为长为 横坐标标， 获获得的谱线谱线 即为为旋光光谱谱。 摩尔旋光度与比旋光度 的换换算关系： = M 100 式中，M为为待测测物质质分子量 。 41 ORD图谱测定 旋光光谱谱是非吸收光谱谱，不具有紫外吸收的手性化合物也可测测定ORD 光谱谱。化合物无发发色团时团时 ，对对旋光度为负值为负值 的化合物，ORD谱线谱线 从紫外 到可见见光区呈单调单调 上升；而旋光值为值为 正的化合物是单调单调 下降，这类这类 ORD 谱线谱线 称为为正常的或平坦的旋光谱线谱线 。 42 ORD图谱测定 分子中有一个简单的发色团的ORD谱线，在紫外光谱max处越 过零点，进入另一个相区，形成的一个峰和一个谷组成的ORD谱线。 Cotton效应（CE）：在接近所测化合物的紫外最大吸收波长处出 现的异常S曲线。（法国Aime Cotton） 43 ORD图谱测定 44 A B C ORD图谱测定 实际的ORD曲线是分子中各个发色团CE的加合结果。因此，ORD 谱线常呈复杂情况。 45 CD图谱测定 圆二色谱（Circular dichroism，CD） 以摩尔椭圆度或吸光度差为纵坐标，以波长为横坐标， 获得的谱线为圆二色谱。 摩尔椭圆度与吸光度差 的换换算关系为为： 3300 46 ECD检测检测 波长长：175 900nm =L-R = A / Cl = (dL-dR) / C l d 为为光密度；C 为为物质质的量浓浓度 mol/L；l 为为池长长。 CD仪仪器记录椭圆记录椭圆 偏振光的椭圆椭圆 度（millidegrees，mdeg）， 文献报报道通常使用摩尔椭圆椭圆 度： = ()M/100lc c单单位：g/mL，l单单位：dm CD图谱测定 47 CD图谱测定 Prism Slit 48 1.光源：氙灯 2.起偏器：Nicole棱镜镜（天然方解石）、Rochon棱镜镜（结结晶状石英） 3.调调制解调调器（CDM）：在其上施加几万赫兹兹的高频频交变电压变电压 ，作用 是将单单色的平面偏振光以这这种频频率交替地变变化为为左旋、右旋圆圆偏振光 。 4.光电电倍增管（PM） 5.样样品池 6.氮气保护护装置 CD图谱测定 Cotton效应：平滑曲线在所测化合物的最大吸收波长处出现的异常 峰状或谷状曲线。 49 CD图谱测定 CD光谱是吸收光谱，只有具有紫外吸收的手性化合物可以测定CD光谱。 紫外光谱、旋光光谱及圆二色谱的关系 50 Cotton效应 在化合物紫外最大吸收处，是ORD产生Cotton效应谱线跨越基线 的位置；是CD产生Cotton效应谱线的位置。 51 Cotton效应 在紫外可见见区域，用不同波长长的左旋、右旋圆圆偏振光测测量CD和ORD 的主要目的是研究有机化合物的绝对绝对 构型或构象。在这这方面，ORD和CD所 提供的信息是等价的，实际实际 上它们们之间间有固定的关系。 CD谱谱比较简单较简单 明确，容易解析。ORD谱谱比较较复杂杂，但它能提供更多 的立体结结构信息。对对于有多个紫外吸收峰的化合物，就会有多个连续变连续变 化 的CD谱线谱线 和相应应的ORD谱线谱线 。 52 CE是研究手性化合物绝对绝对 构型及优势优势 构象的依据，有机手性 化合物具有以下三种结结构特点即可产产生具有CE的CD图谱图谱 。 Cotton效应 1.含有结构不对称的生色团，如共轭的二烯类、,-不饱和酮类、六螺 旋烃等，可研究骨架的立体化学。 53 Cotton效应 2.含有处于不对称环境中的结构对称的生色团，如酮基类、,-不饱 和酮类、双键类、苯甲酸酯类、芳香化合物等，可研究手性中心的 立体化学。 54 Cotton效应 3.含有两个或多个具有* 跃跃迁的生色团团，当其电电子跃跃迁偶极矩不 平行时时具有相互作用，产产生激发态发态 手征性图谱图谱 ，可研究骨架及手性 中心的立体化学。 55 CD解谱方法 三、圆二色谱解谱方法 经验规则经验规则 ：八区律、扇形规则规则 、螺旋规则规则 半经验经验 方法：激发态发态 手征性 量化计计算：ORD、ECD、VCD计计算 56 化合物类型解谱方法 饱和环己酮、饱和环戊酮类八区律 ,-不饱和环酮类八区律，螺旋规则 ,-不饱和环酮类八区律 烯丙醇及其酯类螺旋规则 苯乙烯及共轭同系物螺旋规则 内酯类八区律，扇形规则 CD解谱方法 基本原则之一：对映性规则（Antipodality ） 57 对结构类似的一系列化合物，如 果已知一个化合物的绝对构型，其类 似物的绝对构型可通过比较CD确定。 具有相同CE，表明它们的绝对构 型相同；具有相反CE，表明它们的绝 对构型相反。 CD解谱方法 58 基本原则之二：附近性规则（Vicinity） CD解谱方法 对对于生色团羰团羰 基，影响其CE符号的不对对称因素的权权重可依1 2 3 4考虑虑。距生色团较远团较远 的不对对称碳原子基本不影响。因此，对对生色团团CE有 影响的不对对称碳原子的绝对绝对 构型可利用该该生色团团的CE特征来确定。 红红点为为不对对称碳原 子 59 CD解谱方法 1、八区律规则 八区律是通过饱过饱 和环酮环酮 中羰羰基生色团团的CE，解析与其附近手 性中心的绝对绝对 构型的经验规则经验规则 。它建立在n*电电子跃跃迁（ 290nm）理论论研究的基础础之上。 在平面上的原子对CE贡献为0，在前四区和后四区的原子对CE的 贡献具有加合性。 60 CD解谱方法 61 CD解谱方法 62 CD解谱方法 (+)-3-methylcyclohexanone 24D = +13.5, UV: 0.0245mol/L in MeOH, max 282nm, 18. 63 (+)-3-Methylcyclohexanone的CD图谱图谱 (+)-3-Methylcyclohexanone的ORD图谱图谱 CD解谱方法 (+)-3-methylcyclohexanone is R. 64 CD解谱方法 注意如何将结构式放入八区空间，并如何观察各区的贡献。 胆甾酮酮-2 65 CD解谱方法 66 胆甾酮-3 CD解谱方法 a) 饱和环戊酮的八区律及投影 67 CD解谱方法 羰羰基两侧侧的平伏卤卤素（或乙酰酰氧）取代基对对CE影响较较小，但可以 使振幅A增加；直立卤卤素取代基则则可以使CE红红移，并使CE符号改变变。 68 CD解谱方法 b) 直立卤卤代酮规则酮规则 69 CD解谱方法 X-单单晶衍射表明化合物（13）Br-为为平展键键，如构象A；但CD表明 为为（-）-CE，即溶液中为为构象B。 ,-不饱饱和环环己酮酮有两个Cotton效应带应带 ： 70 CD解谱方法 u320-350nm (n*) Cotton效应应 可应应用八区律解析图谱图谱 u220-260nm (*) Cotton效应应 可应应用螺旋规则规则 解析图谱图谱 c) ,-不饱饱和环环己酮酮的八区律 71 - 当共轭双键与羰基在一个平 面上，而其它环碳在平面外时， 则环碳的位置决定CE的正负。 当双键与羰基不在一个平面上 ，双键的位置决定CE的正负。适用 于六元和七元环的,-不饱和环酮 。 注意：后四区符号与饱和环己酮的相反。 CD解谱方法 + + + - - + - -+ 72 CD解谱方法 注意：后四区符号与饱和环己酮的相同，但与,-不饱和环己酮的相反 。 d) ,-不饱饱和环环戊酮酮的八区律 可应应用于不饱饱和酮酮、二烯烯、螺（扭曲）烯烯、二硫化物等* 跃跃迁生色团团的CE判断。 220-260nm (+)-CE220-260nm (-)-CE Cisoid transoid Cisoid transoid 73 CD解谱方法 2、螺旋规则 74 化合物1-methyl-19norprogesterones(VII) 及其C-1异构体（VIII） CD解谱方法 VIIVIII 对对于,-不饱饱和环环己酮酮，可观观察320-350nm处处CE的正负负，判 断环环上突出平面的碳原子在环环上方还还是环环下方。 75 CD解谱方法 化合物VII及其C-1异构体（VIII）的C=C-C=O生色团具有相反的 手性（240-260nm)，应用螺旋规则可以确定它们的绝对构型。 76 CD解谱方法 内酯酯基团团在210-220nm范围围内有一弱的吸收带带，为为n*电电 子跃跃迁，其CE可用八区-扇形规则规则 以及另一经验规则预测经验规则预测 。 八区分布： 77 CD解谱方法 3、内酯的八区-扇形规则 78 扇形分布： 注意：从分子结构上面投影观察 CD解谱方法 注意：沿着O-C-O 角的平分线观线观 察，按照八区律方式投影。 79 CD解谱方法 80 注意：从上面观观察分子，投影到内酯酯的平面上。 CD解谱方法 或内酯酯中C-CO-O-C 倾倾向于共平面成为为一个稳稳定 的构象，碳原子或处处于该该平 面上或下，可用于CE的预测预测 。 碳原子在该该内酯酯平面上 呈现现（+）-CE，在该该内酯酯平 面下呈现现（-）-CE。 内酯的另一经验规则的应用 经验证经验证 明：决定n*电电子跃跃迁产产生的CE正负负的主要是内酯环酯环 的 手性，而不是或位的取代基的位置。 81 CD解谱方法 82 桥环桥环 内酯酯基团处团处 于平面状态时态时 ，有两种构型。一般主要以-内酯酯 为观为观 察对对象，碳原子在该该内酯酯平面上呈现现（+）-CE，在该