基于澳大利亚TGA标准的南药(巴戟天)质量评价及其产品开发.docx

/sundae_meng基于澳大利亚TGA标准的南药（巴戟天）质量评价 及其产品开发工作总结报告项目名称：基于澳大利亚TGA标准的南药（巴戟天）质量评价 及其产品开发项目类别：项目研发、产业化及资金配套 项目编号： 完成单位：XX市RR天然药物有限公司XX大学药学院生药与天然药物化学实验室 主管部门：XX火炬开发区科学技术委员会 完成日期：XX市RR天然药物有限公司 项目简介：巴戟天为岭南特色道地药材，具有补肾壮阳之功效，是广东中医 药发展“十一五”规划重点发展品种，也是中国、澳大利亚消费者需 要，并有市场发展前景的南药品种。本项目基于2007年国家科技部中 澳合作特别基金（题目：金丝桃属植物与南药巴戟天质量标准及其抗 炎、抗抑郁化学成分研究，杨得坡教授，Basil Roufogalis（悉尼大 学药学院），国科金外资助第30811120115号）研究成果，促进健康基 地参与国际合作的基本需要，开展药材巴戟天质量标准与新产品开发 研究共同行动计划，加强“项目-人才-基地”的国际合作，并通过中 国药材巴戟天基于澳洲TGA要求的糖浆或口服液开发研究，为健康企 业进入澳大利亚，乃至欧盟奠定基础。巴戟天的质量评价，常规的安全性保证是第一步，对有效成分的 控制是更高层次的质量评价的内容。巴戟天国家标准目前还停留在安 全性控制，缺乏对于药效物质的监控。药效物质基础的质量直接影响 巴戟天的应用功效。故此应该从药效物质基础的角度出发，提高现行 的药材标准，保证用药的安全、有效、质量稳定。对于巴戟天质量的 评价不能单是停留在对某一个或者一类有效成分考察，应该是多类成 分多个指标的共同的评价。巴戟天多糖是巴戟天补肾壮阳、强壮筋骨的重要物质基础。然而， 对于巴戟天多糖的提取、分离、纯化报道较少，对纯化多糖的理化性 质及结构特征的研究更是缺乏。鉴于此，该课题重点对巴戟天多糖成 分进行系统的提取、分离、纯化研究，考察纯化多糖的理化性质及结构特征，在此基础上，对巴戟天多糖抗疲劳、清除自由基活性进行了评价，旨在探讨巴戟天抗疲劳、抗氧化药效物质基础。此外，对巴戟 天活性小分子成分进行分离和结构鉴定，对抗炎镇痛有效成分水晶兰 苷的含量进行分析测定。同时在巴戟天多糖深入研究开发的基础上，XX市RR天然药 物有限公司以巴戟天多糖研究为模板申报了5个寡糖类产品(糖浆)。目录第一部分 项目工作总结与主要成果一、项目基本情况1、项目背景2、合同规定的技术指标与完成情况对比二、项目执行情况1、研究技术与工作情况2、总经费、科技经费的投入和使用情况三、 技术、经济指标完成情况1、达到的技术、经济指标（如上）2、已实现和预期达产后新增产值和利税情况3、社会效益四、 取得的主要研究成果及推广应用情况1、取得的主要研究成果2、推广应用情况 五、项目实施对企业的影响 六、 存在问题和前景预测七、项目完成单位与项目主要参加者1、XXRR天然药物有限公司2、XX大学药学院3、主要参加人员I第二部分 基于澳大利亚TGA标准的南药（巴戟天）质量评价及其产品开发摘要第 1 章前言1.1 巴戟天的研究概述1.1.1 巴戟天的生药学研究1.1.2 巴戟天的药效物质基础研究进展1.2 多糖的研究概述1.2.1 多糖的来源1.2.2 多糖的提取分离纯化1.2.3 多糖的理化性质及结构研究1.2.4 多糖的药理活性1.2.5 多糖的临床应用1.3 本论文研究的目的、内容及意义1.4 本论文研究的基本思路及实施方案第 2 章巴戟天多糖的制备2.1 巴戟天多糖的制备过程2.1.1 巴戟天多糖的提取2.1.2 巴戟天多糖的分离、纯化2.2 巴戟天多糖的制备工艺路线图第 3 章巴戟天多糖制备工艺优化3.1 材料与仪器3.2 实验方法3.2.1 提取工艺考察3.2.2 醇沉工艺研究II3.2.3 脱蛋白工艺3.2.4 脱色工艺3.2.5 透析除杂3.2.6 DEAE-Sepharose CL-6B 离子交换色谱分离3.2.7 凝胶滤过色谱分离3.3 结果与讨论3.3.1 提取工艺3.3.2 醇沉工艺3.3.3 脱蛋白工艺3.3.4 脱色工艺研究3.3.5 透析工艺研究3.3.6 DEAE-Sepharose CL-6B 离子交换色谱分离3.3.7 凝胶滤过色谱 Sephadex G-75 及 Sephadex G-100 柱分离3.3.8 小结第4章巴戟天多糖抗疲劳及清除自由基活性 的评价4.1 巴戟天多糖抗疲劳药理活性评价4.1.1 仪器、试剂、受试药物及受试动物4.1.2 实验方法4.1.3 结果4.2 巴戟天多糖 DPPH 自由基清除活性的评价4.2.1 仪器及试剂4.2.2 实验方法4.2.3 结果4.3 小结第 5 章讨论与展望5.1 本研究成果总结与讨论35.2 巴戟天药效物质基础与质量评价探讨5.3 仍需要深入探讨的领域或内容参考文献4第一部分项目工作总结与主要成果2一、项目基本情况1、项目背景根据广东省人民政府、教育部、科技部关于组织实施省部企业科技特派员 行动计划的通知（粤府办200850 号）的精神，2009 年 2 月 25 日XX大学 杨得坡教授作为省部企业科技特派员派驻XXRR天然药物有限公司，时间 为：从 2009 年年 3 月至 2011 年 2 月。派驻期间，杨得坡教授担任企业的技术 总监与首席科学家，期间承担了本项目。项目名称：基于澳大利亚 TGA 标准的南药（巴戟天）质量评价及其产品开发 项目编号：2009H010计划类别：项目研发、产业化及资金配套实际上，该项目属于XX大学 2007 年申请获得了 2007 年中澳合作交流特别 基金（07 年中澳合作交流特别基金：金丝桃属植物与南药巴戟天质量标准及其 抗炎、抗抑郁化学成分研究，杨得坡）项目内容，该项目还列入（1）2008 年广东省国际合作项目，基于澳洲 TGA 药材注册的南药质量评价体 系示范研究，总经费 20 万元，主持人：杨得坡。（2）基于 TGA（南药）质量标准与注册研究，09 国家科技部国际合作，总经 费 168 万元，主持人：杨得坡。2、 合同规定的技术指标与完成情况对比合同（H2009H010）规定的技术指标如下：（1）基于 TGA 标准，建立巴戟天的药材质量评价体系与质量标准；（2）在膜分离技术分离巴戟天抗抑郁寡糖的工艺（已经完成）基础上，通过 本项目进一步建立膜生产工艺的中试标注，按 2005 药典质量的要求，优化工艺， 并完成所有的与新工艺有关的技术改造，使生产出来多糖的纯度超过 90%；（3）阐明巴戟天寡糖特有或重要的成分及立体结构，完成巴戟天抗疲劳理评价，为巴戟天寡糖口服液申报新药提供实验数据；（4）申请中国或国际发明专利至少 2 项；（5）在国内核心或国际专业杂志发表文章至少 5 篇。课题组已完成（1）、（2）、（3）和（5），同时取得 5 个产品批准（新增加），（4）（发明专利）由于相关工作还需验证，专利申报的研究工作还没有完成，因 此，从整体上看完成了合同的技术要求。二、项目执行情况1、研究技术与工作情况巴戟天系茜草科（Rubiaceae）巴戟属（Morinda Linn.）多年生攀援木质藤 本植物巴戟天 Morinda officinalis How 的干燥根。主要分布于广东、广西、福 建等省，是我国著名的“四大南药”之一。本品性微温、味甘辛，有补肾阳、强 筋骨、祛风湿之功效。在临床中，用于治疗阳痿遗精，宫冷不孕，月经不调，风 湿痹痛，筋骨痿软等。巴戟天多糖是巴戟天补肾壮阳、强壮筋骨的重要物质基础。然而，对于巴戟 天多糖的提取、分离、纯化报道较少，对纯化多糖的理化性质及结构特征的研究 更是缺乏。鉴于此，本文重点对巴戟天多糖成分进行系统的提取、分离、纯化研 究，考察纯化多糖的理化性质及结构特征，在此基础上，对巴戟天多糖抗疲劳、 清除自由基活性进行了评价，旨在探讨巴戟天抗疲劳、抗氧化药效物质基础。此 外，对巴戟天活性小分子成分进行分离和结构鉴定，对抗炎镇痛有效成分水晶兰 苷的含量进行测定。研究工作概述如下：（1）巴戟天多糖的制备：介绍巴戟天多糖的制备过程，在此基础上确定巴 戟天多糖制备工艺路线图：95乙醇提取脱脂除寡糖，热水提取多糖，95乙醇3醇沉，Sevag 试剂脱蛋白，活性碳脱色，透析袋透析除杂，DEAE-Sepharose CL-6B离子交换色谱及 Sephadex G-75、Sephadex G-100 凝胶滤过色谱联合分离纯化， 最后得到三个纯化多糖，MP-1、MP-2 和 MP-3。（2）巴戟天多糖制备工艺的优化：采用传统的热水提取法，以多糖提取得 率为指标，考察提取温度、时间、次数、液料比等工艺参数；以多糖醇沉得率为 指标，考察乙醇沉淀工艺；以多糖损失率、脱蛋白率为指标，考察脱蛋白工艺； 以脱色前后多糖溶液的颜色变化以及多糖的损耗率为指标，考察脱色工艺；考察 透 析 工 艺 ； 以 硫 酸 - 苯 酚 法 检 测 多 糖 ， 考 马 斯 亮 蓝 法 检 测 蛋 白 质 ， 考 察 DEAE-Sepharose CL-6B 离子交换色谱层析及 Sephadex G-75、Sephadex G-100 凝胶滤过色谱层析纯化工艺。确定巴戟天多糖最佳的提取、分离、纯化工艺。巴 戟天总多糖 MOA 的得率为 23.28（以生药量计算），纯化多糖 MP-1、MP-2 和 MP-3 的得率分别为 27.32、7.85、20.57（以 MOA 计算）。（4）巴戟天多糖小鼠抗疲劳及体外清除自由基活性评价：采用小鼠负重游 泳模型，评价巴戟天多糖抗疲劳活性，考察指标有小鼠体重的变化，负重游泳时 间，以及小鼠血清尿素氮、血乳酸、肝糖元三项生化指标。结果巴戟天多糖剂量 组小鼠体重都呈增长趋势，但与对照组比较无显著差异；能显著提高小鼠负重游 泳时间；降低运动后小鼠血乳酸、血清尿素氮含量；并能增加小鼠肝糖原含量， 提示有明显的抗疲劳作用，特别是中、高剂量组。采用经典的体外 DPPH 清除模 型，评价巴戟天多糖清除自由基活性。结果巴戟天多糖具有与剂量相关的 DPPH 自由基清除能力，其中以巴戟天总多糖 MOA 的效果最为明显，当浓度达到 5 mg/mL 以上时，其自由基清除率比阳性对照品 Vc 和 BHT 还要高。巴戟天多糖抗疲劳、 清除自由基的活性，提示巴戟天多糖为巴戟天抗疲劳、抗氧化的重要活性物质基 础。2、总经费、科技经费的投入和使用情况本项目实际总投资 158 万元，其中包括了 07 年省科技厅中澳国际合作项目（20 万元）、09 国家科技部中澳国际合作项目（118 万元，该项目合计经费 168 万元）与XX市科技局经费 20 万元，科技经费使用如下：9项目经费使用情况 （万元）合同约定项目总经费140 万元其中:市科技经费20 万元项目实际到位经费158 万元其中:市科技经费20 万元项目实际支出158 万元其中:市科技经费20 万元支出科目项目总经费开支其中市科技经费 开支基建费其中原材料费63.3试剂、药品、药材、玻璃仪器等科研消耗 其中药材、辅料、设备配套部件等生产消耗205.338仪器设备购置及使用费12.8设备维修与零配件120.8其中专用业务费78.6提取分离，结构测定与含量分析398.6其中产品制剂工艺、质量标准与中试31其他23.3项目管理，差旅、研究生培养185.3其中总计15820三、 技术、经济指标完成情况1、达到的技术、经济指标（如上）（1）确定巴戟天多糖制备工艺路线图，最后得到三个纯化多糖。（2）确定巴戟天总多糖最佳的提取、分离、纯化工艺。（3）采用小鼠负重游泳模型，评价巴戟天多糖抗疲劳活性，发现巴戟天多糖抗 疲劳、清除自由基的活性。（4）发表文章篇；（5）获得多糖类产品批文个2、已实现和预期达产后新增产值和利税情况原合同要求完成 500 万元的经济指标，公司到目前为止（截止至 2010 年 11月 30 日）已完成销售 605 万元（包括独联体销售 530 万元），实际收入 122 万元 左右。同时培养研究生 5 名（其中 3 名常驻RR公司），技术人员 3 名。3、社会效益XX健康科技产业基地在广东省中药行业的地位举足轻重，中成药是广东省 具有传统优势的产业之一。XX健康科技产业基地医药工业因为起步早，企业实 力及品牌影响有一定的先发优势，中药产业生产、销售、品种、效益等方面也取 得一定成绩。但与广东其他医药大市（如：广州）比较，中药企业规模偏小，实 力分散，品牌整合能力不足，缺少有全国影响力的大企业集团和国际竞争力的强 势大品牌和知名大品种。中药产业是典型的低碳环保与国家重点支持并优先支持的产业， 本项目以“中药多糖产品开发与国际化注册示范研究”为契机，通过对中药多糖类化合物的药效研究、安全性评价与质量标准研究，全面提高产品的科技含 量，可快速增强产品和品牌的市场竞争力，扩大市场规模和影响力，打造名企、 名药，从而进一步巩固和扩大健康基地在全国的影响力。四、 取得的主要研究成果及推广应用情况1、取得的主要研究成果巴戟天系茜草科（Rubiaceae）巴戟属（Morinda Linn.）多年生攀援木质藤 本植物巴戟天 Morinda officinalis How 的干燥根。主要分布于广东、广西、福 建等省，是我国著名的“四大南药”之一。本品性微温、味甘辛，有补肾阳、强 筋骨、祛风湿之功效。在临床中，用于治疗阳痿遗精，宫冷不孕，月经不调，风 湿痹痛，筋骨痿软等。巴戟天多糖是巴戟天补肾壮阳、强壮筋骨的重要物质基础。然而，对于巴戟 天多糖的提取、分离、纯化报道较少，对纯化多糖的理化性质及结构特征的研究 更是缺乏。鉴于此，本文重点对巴戟天多糖成分进行系统的提取、分离、纯化研 究，考察纯化多糖的理化性质及结构特征，在此基础上，对巴戟天多糖抗疲劳、 清除自由基活性进行了评价，旨在探讨巴戟天抗疲劳、抗氧化药效物质基础。此 外，对巴戟天活性小分子成分进行分离和结构鉴定，对抗炎镇痛有效成分水晶兰 苷的含量进行测定。研究成果概述如下：（1）巴戟天多糖的制备：介绍巴戟天多糖的制备过程，在此基础上确定巴 戟天多糖制备工艺路线图：95乙醇提取脱脂除寡糖，热水提取多糖，95乙醇 醇沉，Sevag 试剂脱蛋白，活性碳脱色，透析袋透析除杂，DEAE-Sepharose CL-6B 离子交换色谱及 Sephadex G-75、Sephadex G-100 凝胶滤过色谱联合分离纯化， 最后得到三个纯化多糖，MP-1、MP-2 和 MP-3。（2）巴戟天多糖制备工艺的优化：采用传统的热水提取法，以多糖提取得 率为指标，考察提取温度、时间、次数、液料比等工艺参数；以多糖醇沉得率为 指标，考察乙醇沉淀工艺；以多糖损失率、脱蛋白率为指标，考察脱蛋白工艺； 以脱色前后多糖溶液的颜色变化以及多糖的损耗率为指标，考察脱色工艺；考察 透 析 工 艺 ； 以 硫 酸 - 苯 酚 法 检 测 多 糖 ， 考 马 斯 亮 蓝 法 检 测 蛋 白 质 ， 考 察 DEAE-Sepharose CL-6B 离子交换色谱层析及 Sephadex G-75、Sephadex G-100 凝胶滤过色谱层析纯化工艺。确定巴戟天多糖最佳的提取、分离、纯化工艺。巴 戟天总多糖 MOA 的得率为 23.28（以生药量计算），纯化多糖 MP-1、MP-2 和 MP-3的得率分别为 27.32、7.85、20.57（以 MOA 计算）。（4）巴戟天多糖小鼠抗疲劳及体外清除自由基活性评价：采用小鼠负重游 泳模型，评价巴戟天多糖抗疲劳活性，考察指标有小鼠体重的变化，负重游泳时 间，以及小鼠血清尿素氮、血乳酸、肝糖元三项生化指标。结果巴戟天多糖剂量 组小鼠体重都呈增长趋势，但与对照组比较无显著差异；能显著提高小鼠负重游 泳时间；降低运动后小鼠血乳酸、血清尿素氮含量；并能增加小鼠肝糖原含量， 提示有明显的抗疲劳作用，特别是中、高剂量组。采用经典的体外 DPPH 清除模 型，评价巴戟天多糖清除自由基活性。结果巴戟天多糖具有与剂量相关的 DPPH 自由基清除能力，其中以巴戟天总多糖 MOA 的效果最为明显，当浓度达到 5 mg/mL 以上时，其自由基清除率比阳性对照品 Vc 和 BHT 还要高。巴戟天多糖抗疲劳、 清除自由基的活性，提示巴戟天多糖为巴戟天抗疲劳、抗氧化的重要活性物质基 础。（5） 申请并获得了 5 个多糖类产品批文。2、推广应用情况课题组在巴戟天多糖研究的基础上，扩大研究范围，申报更多市场需要的产 品，目前公司已经申请并获得了 5 个多糖类产品批文，这 5 个多糖产品及批准文 号如下：（1） 低聚果糖红茶饮（Q/UNIC001S-2009）（2） 花香型低聚果糖浆（Q/UNIC005S-2009）（3） 低聚果糖锌饮液（Q/UNIC001S-2010）（4） 低聚果糖铁饮料（Q/UNIC002S-2010）（5） 植物低聚果糖浆（Q/UNIC006S-2010）寡糖是指单糖数在 29 个以糖苷键结合而成的一类多糖，寡糖为双歧杆菌的 增殖因子, 属功能性低聚糖, 寡糖不被胃酸胃酶分解，在大肠中可被双歧杆菌利 用而不能被有害菌利用。低聚糖有利于人体肠内双歧杆菌的增加，同时可抑制肠 内有害菌及腐败物质的形成，恢复肠胃道微生态系统的良性发展，同时寡糖还具有调节人体免疫力、降低血脂、降低血压、抑制病原菌生长和腹泻及防止便秘等多种重要生理功能。五、项目实施对企业的影响由于本项目的实施，直接促进了公司与XX大学的产学研合作，尤其对促进 RR公司参与XX大学的国际合作发挥的关键作用，也由于这个原因，公司获 得了 2011 年广东省科技厅对外合作项目 1 项。目前公司主要在四个方面开展合 作与交流：1. 合作发展分子蒸馏中药有效成分纯化技术，解决中药提取物质量控制与 标准化共性技术，面向国际市场，促进中药国际化与标准化，XXRR公司已 经成为中国设备与技术最完整、专业化水平最好的机构之一；2. 与大学合作，开发具有知识产权保护的新药与健康产品，促进大学科技成果转移，公司目前拥有发明专利 8 项，是健康基地拥有发明专利最多的单位之 一；3. 发展产学研基地的作用，共同实施研究计划，目前公司与XX大学联合承担了 3 项产学研或国际合作项目；4. 企业接受大学学生实习，提高企业的科技水平与科技能力，公司目前有3 名XX大学的硕士研究生在公司开展研究公司，直接参与企业的科技开发。六、 存在问题和前景预测在研究方面，本工作从巴戟天的植物化学、药理活性、质量评价等方面进行 了研究，相关研究结果对于了解巴戟天的药效物质基础提供了必要的启示与参 考。为了更合理的利用与开发巴戟天，发掘其更多的药用价值，尚有许多研究工 作亟待深入，如：（1）巴戟天多糖抗疲劳作用机制的深入探讨疲劳是一种病症，涉及到多种病因，因而抗疲劳的作用机制是比较复杂的。研究报道，抗疲劳活性与抗应激、提高机体免疫力有密切关系。巴戟天多糖的抗 疲劳机制，有待进一步研究。可将免疫调控、细胞生物学、分子生物学、基因工 程学相结合，多层次、多学科对巴戟天的抗疲劳作用机理进行具体化、客观化、 定性定量的研究，全面地探讨其抗疲劳作用机制。这对于加速天然抗疲劳药物的 开发、为疲劳的病因和防治方法提供可靠的论证数据均具有重要意义。（2）巴戟天质量评价体系的提高 如前面所述，一个更科学的质量评价体系必须建立，推动巴戟天的现代化和国际化。（3）巴戟天多糖类产品的开发 巴戟天多糖是巴戟天补肾壮阳、抗疲劳、强身健骨的物质基础，随着其保健功能和药用价值的深入研究，巴戟天多糖相关产品的开发具有巨大的市场潜力。 可以考虑研制口服液、营养液、软胶囊、冲剂等食品或药品，满足市场要求，引 领绿色功能产品新时向。七、项目完成单位与项目主要参加者1、XXRR天然药物有限公司XXRR天然药物有限公司是一家专业从事天然产物、药物中间体与健康 产品研究、开发、生产与销售的高科技企业，成立于 2004 年 3 月，注册资本 160万元，目前在职人员 23 人，全部具有大专以上文凭。XXRR位于XX市火 炬开发区国家健康科技产业基地园区内，拥有一批从事天然药物、中药、药物化 学、药理学、制药工程等方面的博士，硕士与工程技术人员，并与国内外著名大 学及研究机构建立了很好的合作关系。公司以世界生物医药高新技术和产品为支 柱，中国市场为依托，国内外资本为动力，力求快速发展成为中国重要的，在国 际上有一定影响的，研发机构与产业化基地。XXRR位于最早的国家健康科技基地-生物硅谷，通过企业集群的协作 竞争作用，优惠完善的政府政策法规，周到便利的专业化设施服务，良好的生境17让RR更积极更有效地发展和壮大。XXRR公司的产品系列为红花籽油、亚油酸（linoleic acid）、共轭亚 油酸（conjugated linoleic acid）、功能植物油（不饱和脂肪酸）、天然植物香 料、健康食品、保健品与药品。红花籽油和共轭亚油酸（CLA）是公司的主打产 品，享有品质保障与性能优势，因为，目前国际国内市场上流通的红花籽油、共 轭亚油酸具有溶剂（尤其是有毒、有害溶剂）残留高、水分含量高、颜色深，达 不到 ICH 标准对植物油原料的严格要求。RR公司采用分子蒸馏红花籽油和 CLA 专用技术生产得到的产品，尤其是 溶剂残留、农药残留、重金属残留，以及物理外观，都将按照 ICH 的要求来进行； 同时也由于我们对生产体系与包装、储藏技术采用了特殊的复合保护技术，保障 产品质量稳定可靠，食用安全。目前公司拥有 8 项 CLA 发明专利技术。产品已 经形成系列化：红花籽油、共轭亚油酸、共轭亚油酸乙酯、共轭亚油酸甘油酯、 共轭亚油酸钙、共轭亚油酸薄荷酯、共轭亚油酸肉碱。发展具有知识产权保护的新产品与新技术是XXRR公司的立国之本， 公司到目前为止，已拥有中国发明专利 8 项，产品标准 3 项，科技奖励 2 项，发表相关文章 20 余篇。2、XX大学药学院XX大学和原XX医科大学在中国享有较高的声誉，在国际上也有一定的知 名度，在国内，特别是在华南地区医药领域有较大的影响。强强联合后的新XX 大学各学科优势可以互补和增强，而且随着各级政府主管部门的重视，在各方面 的投入也在增加。承担单位XX大学药学院以创新药物研究开发为主要研究方 向，现有教职工 102 人，其中高中级职称人员 40 人，还有些高层次教学科研人 员在调入过程中。XX大学一期“985”建设工程及国家教育部第二期“211”建 设工程为药学院建设投入了 3000 多万元,实验动物中心投入 1300 万元建设资金； 启动建设的二期“985 工程”学科建设计划“创新药物筛选与评价科技创新平台” 为国家教育部批准立项的XX大学 6 个理科医科类平台之一，共投入 2700 多万 元进行立项及建设。目前，作为国家教育部三期“211”工程重点建设单位，三期“211 工程”重点学科建设项目“基于华南天然产物活性成分的结构改造、筛选及新药研发”等 9 个项目的可行性研究报告已获教育部正式批复同意建设，获批资金 700 万，可为中标项目提供配套资金。XX大学药学院作为作为作为XX 大学“985”建设工程及国家教育部十五“211”建设工程重点建设单位（项目）， 仪器设备完备，能充分满足本课题的研究需要。目前 10 万元以上仪器设备有 80 多台。已有设备条件：TSQ-2000 液相层析质谱仪、TRACE DSQ 气相色谱-质谱联 用仪（Finaga）、牛津 X-射线单晶衍射仪、waters 超高效液相色谱-串联质谱联 用仪及超高效液相色谱仪、tripos 药物设计软件系统等、AXON 膜片钳系统、流 式细胞仪、GE 快速蛋白液相色谱系统、PTI 荧光稳态光谱分析系统(荧光偏振)、 PerkinElmer 液体闪烁计数仪、IX71 倒置荧光显微镜、96 孔核转染系统、300MHz 超导核磁共振谱仪、傅里叶变换红外光谱联用 HELIOS 附件式红外显微镜、气- 质联用仪、HPLC（12 台，配二极管阵列-电化学-荧光检测器）、多通道自动固相 萃取仪、RlgaKu3030E3 型 X-射线衍射仪（日本理学）、热分析仪（梅特勒-托利 多，瑞士）、傅里叶变换红外光谱仪、LTE-S 型贴剂涂布机 (瑞士 Werner Mathis AG)，EXDS-60Q-230 挤出-滚圆造粒机 (Fuji Paudal)，BUCHI B-191 小型喷雾干 燥机 (Lab-plant limited 公司)， RZQ-8A 智能溶出仪取样系统，FLP1.5 型一 步造粒机，BZJ-360M型离心造粒包衣机 ，WBF-1 多用途硫化床，SCM-100 软胶 囊机、超微粉碎机、工业微波干燥机、28 冲高速压片机、防爆喷雾干躁制粒器、 10 升 CO2 超临界萃取器,颗粒包装机、Rotofor 等电聚焦电泳仪及蛋白纯化系统， 电泳仪及电转膜仪，Pac200 电泳仪，紫外分光光度计，薄层扫描仪、基因扩增 仪，真空印迹转移仪，低温高速离心机，超低温冰箱，荧光倒置显微镜，蛋白核 酸仪，双向电泳及酶切系统、全自动生化分析仪、低温超速离心机、双向电泳及 分析系统、血流记录仪二氧化碳培养箱、血液流量计、生化培养箱、多道生理 记录仪、全自动切片机、染色机、包埋机等全套病理设备设备。建有标准实验大 楼，配有合格 SPF 级实验动物场地。本项目是由药学院生药及天然药化实验是以生药学与天然药物化学实验室（天然药物与中药研究所）负责实施，实验室主要从事中草药化学成分与天然药 物的研究与开发，有关工作已取得关键进展，发表相关文章 200 余篇，发明专利32 项，发现并定名的植物新种（新分类群）6 个。这些研究不但具有重要的学术价值，如药效成分提取分离技术、结构测定、结构改造与修饰，而且也具有非常明确的应用前景，如超临界萃取技术、分子蒸馏技术、标准提取物技术、共轭亚 油酸（CLA）、抗抑郁药物、抗菌与抗病毒药物等。该实验室师资队伍是一支由留 学归国人员为学术带头人组成的年轻团队，实验室与澳大利亚悉尼大学、法国斯 特拉斯堡大学、弗朗什-孔泰大学，日本 Ochanomizu University 与香港大学有 很好的合作交流关系，学术带头人是杨得坡教授（法国药学博士，生药学）与王 冬梅副教授（日本食品与药物分析学博士，天然药物化学）。3、主要参加人员参加人员排名如下：。第二部分基于澳大利亚TGA标准的南药（巴戟天）质 量评价及其产品开发基于澳大利亚TGA标准的南药（巴戟天）质量评价及其产品开发摘要巴戟天系茜草科（Rubiaceae）巴戟属（Morinda Linn.）多年生攀援木质藤本 植物巴戟天 Morinda officinalis How 的干燥根。主要分布于广东、广西、福建等 省，是我国著名的“四大南药”之一。本品性微温、味甘辛，有补肾阳、强筋骨、 祛风湿之功效。在临床中，用于治疗阳痿遗精，宫冷不孕，月经不调，风湿痹痛， 筋骨痿软等。巴戟天多糖是巴戟天补肾壮阳、强壮筋骨的重要物质基础。然而，对于巴戟 天多糖的提取、分离、纯化报道较少，对纯化多糖的理化性质及结构特征的研究 更是缺乏。鉴于此，本文重点对巴戟天多糖成分进行系统的提取、分离、纯化研 究，考察纯化多糖的理化性质及结构特征，在此基础上，对巴戟天多糖抗疲劳、 清除自由基活性进行了评价，旨在探讨巴戟天抗疲劳、抗氧化药效物质基础。此 外，对巴戟天活性小分子成分进行分离和结构鉴定，对抗炎镇痛有效成分水晶兰 苷的含量进行测定。研究内容概述如下：1 巴戟天多糖的制备 介绍巴戟天多糖的制备过程，在此基础上确定巴戟天多糖制备工艺路线图：95乙醇提取脱脂除寡糖，热水提取多糖，95乙醇醇沉，Sevag 试剂脱蛋白， 活性碳脱色，透析袋透析除杂，DEAE-Sepharose CL-6B 离子交换色谱及 Sephadex G-75、Sephadex G-100 凝胶滤过色谱联合分离纯化，最后得到三个纯化多糖， MP-1、MP-2 和 MP-3。2 巴戟天多糖制备工艺的优化 采用传统的热水提取法，以多糖提取得率为指标，考察提取温度、时间、次数、液料比等工艺参数；以多糖醇沉得率为指标，考察乙醇沉淀工艺；以多糖损 失率、脱蛋白率为指标，考察脱蛋白工艺；以脱色前后多糖溶液的颜色变化以及多糖的损耗率为指标，考察脱色工艺；考察透析工艺；以硫酸-苯酚法检测多糖，考马斯亮蓝法检测蛋白质，考察 DEAE-Sepharose CL-6B 离子交换色谱层析及 Sephadex G-75、Sephadex G-100 凝胶滤过色谱层析纯化工艺。确定巴戟天多糖 最佳的提取、分离、纯化工艺。巴戟天总多糖 MOA 的得率为 23.28（以生药 量计算），纯化多糖 MP-1、MP-2 和 MP-3 的得率分别为 27.32、7.85、20.57（以 MOA 计算）。4 巴戟天多糖小鼠抗疲劳及体外清除自由基活性评价 采用小鼠负重游泳模型，评价巴戟天多糖抗疲劳活性，考察指标有小鼠体重的变化，负重游泳时间，以及小鼠血清尿素氮、血乳酸、肝糖元三项生化指标。 结果巴戟天多糖剂量组小鼠体重都呈增长趋势，但与对照组比较无显著差异；能 显著提高小鼠负重游泳时间；降低运动后小鼠血乳酸、血清尿素氮含量；并能增 加小鼠肝糖原含量，提示有明显的抗疲劳作用，特别是中、高剂量组。采用经典 的体外 DPPH 清除模型，评价巴戟天多糖清除自由基活性。结果巴戟天多糖具有 与剂量相关的 DPPH 自由基清除能力，其中以巴戟天总多糖 MOA 的效果最为明 显，当浓度达到 5 mg/mL 以上时，其自由基清除率比阳性对照品 Vc 和 BHT 还 要高。巴戟天多糖抗疲劳、清除自由基的活性，提示巴戟天多糖为巴戟天抗疲劳、 抗氧化的重要活性物质基础。关键词：巴戟天；多糖；抗疲劳；自由基第 1 章 前言1.1 巴戟天的研究概述1.1.1 巴戟天的生药学研究 本草记载巴戟天系茜草科（Rubiaceae）巴戟属（Morinda Linn.）多年生攀援木质藤 本植物巴戟天 Morinda officinalis How 的干燥根，是我国著名的“四大南药”之 一，收载于中华人民共和国药典中1。(A) (B)图 1-1巴戟天原植物图Fig. 1-1 Plant pictures of Morinda officinalis How (A)巴戟天地上部分(B)巴戟天根(A) The aerial parts of M. officinalis(B) The roots of M. officinalis巴戟天始载于神龙本草经：“出山谷，治大风邪气阳痿不起，强筋骨，安9五脏补中，增志益气，被列为上品。”；陶弘景本草经集注：“壮如牡丹而细，外表赤内黑，用之打心。”；苏敬等新修本草：“巴戟俗名三蔓草，叶似茗，经 冬不枯，根如连珠多者良，宿根青色，嫩根白紫，用之亦同，连珠肉厚者为胜。”；名医别录、图经本草、本草衍义、本草蒙鉴、本草纲目、本草品汇 精要、植物名实图考等文献资料均有巴戟天的相关记载；近代的侯宽昭教授 对当时市售商品巴戟天进行调查并追查原植物，将巴戟天订为茜草科中的一个新 种及其变种，命名为 Morinda officinalis How 和 M. officinalis var. hirsute，沿用至 今，并为药典所收载2, 3。 常见伪品巴戟天在民间广泛应用，不同的地方有不同的使用习惯，所以存在多种别名， 例如鸡肠风、鸡眼藤、黑藤钻、兔仔肠、三角藤、糠藤等。巴戟天为名贵补药， 市场上也存在各种各样的伪品。表 1-1 将已经有报道的伪品进行整理4-9。表 1-1 巴戟天伪品Tab. 1-1 Counterfeits of M. officinalis拉丁名 名称M. angustifolia狭叶鸡眼藤M. citrifolia var. bracteataM. citrifolia var. citrifoliaM. citrifolia var. elliptica海巴戟M. cochinchinensis大果巴戟、黄心藤、三角藤M. pubescens染料鸡眼木M. unbellata鸡眼藤、羊角藤M. parvifolia百眼藤Schisandra propinqua (Wall) Baill，var，sinonsis oliv.香巴戟Damnacanthus officinalum Huang恩施巴戟天Cymbidium faberi Rolfe线兰根 植物形态与地理分布巴戟天为多年生攀援木质藤本。根肉质肥厚，圆柱形，长约 1m，粗 13cm，支根略弯曲，呈连珠状。新鲜时外皮黄白色，干燥后显褐色，表面有明显的不规 则蜿蜒状槽纹。木质心细，易剥落。皮层断面紫红色，味甘而微涩，无气味。茎 圆柱形，有纵条棱，长 12m。幼枝被褐色毛，后脱落变粗糙。叶对生，偶轮生。 叶片长椭圆形，长 313cm，宽 2.55cm，全缘，叶缘有稀疏短毛，先端渐尖， 基部楔形。表面深绿色，背面青绿色，托叶鞘状，膜质。头状花序，210 朵， 伞形排列于枝顶或叶腋。浆果，单个或基部联合成聚合果。成熟时红色，每果 14 个种子。种子近卵形，背部凸起，侧面平坦，被红色短绒毛2, 3, 10。 巴戟天制成药材入药时，形态稍有改变。表面灰黄色或暗灰色，具纵纹及横纵纹，有的皮部横向断离露出木部。断面皮部厚，易与木部剥离，木部坚硬1。 巴戟天是一种生长于热带及南亚热带山地雨林的藤本植物，对温、湿、光风 等因素有特定的要求，形成了“前阴后阳，上阳下阴”的生态学特征。生长条件 的限制，致使巴戟天的分布是以广东省为中心，向东北延伸到北回归线以北的福 建西南部至武平县南部，向西南到达北回归线以南的广西东南部，这就导致巴戟天为特色南药的格局11, 12。 巴戟天的 GAP 种植GAP（good agricultural practice），在农业上译为良好的农业管理规范，在中 药行业是指中药材生产质量管理规范。它的主要内容包括中药材产地环境生 态、种质和繁殖材料，栽培与饲养管理，采收及产地加工、包装、运输与贮藏、 质量管理、人员设备、文件管理等。巴戟天作为名贵中药材，它的市场需求量逐年剧增。而野生药材资源日益匮 乏、濒临衰退和灭绝，优良巴戟天的人工种植成了研究热点。但是多年来药材栽 培在技术上多以药农的经验为主，容易产生品种种质资源不良或退化、种植技术 不规范、重金属和农药残留含量超标等弊端。近些年来相关的巴戟天 GAP 种植 研究取得一定的进展。科研工作者根据实地考察和田间调查，总结了巴戟天生长 过程中对温度、光照、水分、土壤等生态条件的要求。结合产区传统的经验，开 展了对种子育苗方法、病虫害防治、肥料选择、重金属及农残监控、中药材质量 评价等系列的科学研究。开展巴戟天 GAP 基地的建设，规范种植规程，促进绿色中药的优质、高产13-16。 巴戟天的功效巴戟天性微温、味甘辛，归肾、肝经。有补肾阳、强筋骨、祛风湿之功效。 主治阳痿遗精，宫冷不孕，月经不调，风湿痹痛，筋骨痿软等1。目前临床上应 用的巴戟天多为复方制剂，配合淫羊藿，女贞子等药物，起到补肾壮阳的疗效， 例如巴戟丸、赞育丸、金刚丸等。1.1.2 巴戟天的药效物质基础研究进展 巴戟天的化学成分（1）蒽醌类化合物从巴戟天药材里面分到的蒽醌类成分包括：甲基异茜草素(rubiadin)、1- 羟基-2-甲基蒽醌(1-hydroxy-2- methylanthraquinone)、1-羟基-2-甲氧基蒽醌 (1-hydroxy-2-methoxyanthraquinone)、甲基异茜草素-1-甲醚( ruhiadin-l-m ethylether)、2-羟基-1-甲氧基蒽醌(2-hydroxy-l-hydroxymethylanthraquino ne)、1-羟基-3-甲氧基蒽醌(1-hydroxy-3-methoxyanthraquinone)、1,6-二羟基-2,4-二甲氧基蒽醌(1,6-dihydroxy-2，4-dimethoxyanthraquinone)、大黄素甲 醚(physcion)、1,6-二羟基-2-甲氧基蒽醌(1，6-dihydroxy-2-methoxyanthraq uinone)、1,3-二羟基-2- 甲氧基蒽醌(1,3-dihydroxy-2-methoxyanthraquinon e)、l-羟基-2，3-二甲基蒽醌(1-hydroxy-2，3-dimethylanthraquinone)、1- 羟基蒽醌(1-hydroxy-anthraquinone)、2-羟基-3-羟甲基蒽醌(2-hydroxy-3-hy droxymethylanthraquinone)、2-甲基蒽醌(2- methylanthraquinone)以及最近 报道的 1,3，8-三羟基-2-甲氧基蒽醌(1,3，8-trihydroxy-2-methoxyanthraqui none)、2-羟甲基-3-羟基蒽醌(2-hydroxymethyl-3-hydroxyanthraquinone)、2-甲氧基蒽醌(2- methoxyanthraquinone)、1,2-二羟基-3-甲基蒽醌(1，2-dihy droxy-3-methylanthraquinone)等17-22。（2）环烯醚萜类化合物环烯醚萜类化合物主要有：水晶兰苷( monotropein)、车叶草苷(asperulo side)、车叶草苷酸(asperuloside acid)、四乙酰车叶草苷(asperuloside tet raacetate)、去乙酰车叶草苷酸(desacetyl asperuloside acid)、环烯醚萜内 酯 (morindolide)、及环烯醚萜苷(morofficianloside)等21, 23。（3）糖类化合物从巴戟天中分得水溶性低聚糖类成分：耐斯糖(nystose)、1F-果呋喃糖基耐 斯糖(1F-fructofuranosyl-nyslose)、菊淀粉系列的六聚糖(hexasaccharide) 和七聚糖(heptasaccharide)均为菊淀粉型低聚糖24。（4）氨基酸类化合物从巴戟天根的水溶性部分分离得到总氨基酸，含 11 种游离氨基酸和 17 种水 解氨基酸，其中亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、缬氨酸及胱 氨酸 7 种氨基酸为人体必需氨基酸25。（5）挥发性类化合物对巴戟天的挥发油的研究中，提取出的挥发性组分达 50 余个，从中鉴定出的 15 个组分，包括萜、酚、烷、酸、酯及萘胺等成分26。（6）微量元素巴戟天中微量元素含量丰富，微量元素可能是巴戟天临床功效的物质基础之 一。其中含 Fe、Mn、Cu、Zn、Cr、Sn、Ni、Mo、Co、V、Sr 等 11 种人体必需 微量元素27。（7）其它谷甾醇(-sitostero1)及十九烷17，24-乙基胆甾醇(24-ethyle-holestero1) 19，环丙酮类衍生物28。 巴戟天的药理作用（1）补肾壮阳作用巴戟天是重要的补肾壮阳中药之一，近年来研究者对其补肾壮阳的机理进行 现代药理研究。李炳如等29研究发现巴戟天的水煎剂对正常雌性大鼠血中黄体 生成素(LH)水平没有明显影响，但却能明显增加垂体前叶、卵巢和子宫的重量， 特别是它能提高卵巢 HCG/LH 受体功能，推测巴戟天可能不是直接刺激垂体促 黄体激素的分泌而是通过提高垂体对 LRH 的反应性及卵巢对 LH 的反应性来增 强下丘脑-垂体-卵巢促黄体功能。沈道修等30