丙肝病毒分子分型方法.ppt

HCV分子分型方法 陈长荣 ID:21620101152367 丙肝病毒HCV u1975年, 英国Lancet杂志首次使用非甲非 乙型肝炎这个名词 u1989 年, HCV cDNA 克隆成功, 并正式 命名HCV u1991年国际病毒命名委员会( ICTV ) 将 HCV 归为病毒科丙型肝炎病毒属 HCV全球分布情况 HCV基因 u其基因组为单股正链RNA, 易变异。 u全长9. 6 kb u341 b的5非编码区( 5NTR, NCR, UTR ) u27b的3非编码区( 3NRT )。 u在病毒复制中, 氨基酸有三个蛋白( C、E1、E2 /NS1) u羧基端有4个蛋白( NS2、NS3、NS4、NS5) HCV 基因分型分类系统 u不同的研究者建立并使用各自的HCV 分类系 统 u主要的命名系统有: Chan系统、Simmonds 系统、Okamoto 分类系统、Kanazawa命名 系统 u第二届HCV 与相关病毒国际讨论会议上, 制 定了统一的命名系统-Simmonds系统, u目前认为 主要有6 种HCV基 因型及不 同亚型, u以阿拉伯 数字表示 HCV 基因 型, 以小 写的英文 字母表示 基因的亚 型(如1 a 、2 b、3 c等)。 HCV 基因型分布 北美: 1, 3, 2 南美: 1, 2, 3 欧洲: 1, 3, 2 非洲: 2, 1, 3, 4, 5, 6 亚洲: 2, 1, 3, 4, 6 中东: 4 中国：1b，2，6 HCV 基因分型区域的选择 u最准确的方法就是对基因组的某个区进行 PCR 扩增、测序及进化树分析, 选择的区 有NS5、Core、E1和5UTR u通常建立在5 UTR, 因为该区是HCV RNA 诊断实验的常用区域 基因分型的分子学方法 （1）测序法：测全长或片段 u金标准 u费时费力 不适于临床 （2）基因型特异性引物PCR法 uOkamoto等首先采用 u分型的效果仍比较差 u需使用7对引物 uOkamoto H et al. J Gen Virol. (1992) Typing hepatitis C virus by polymerase chain reaction with type-specific primers: application to clinical surveys and tracing infectious sources. ( 3)型特异性探针杂交( LIPA ) u将生物素或荧光素标记型特异性探针固化 相化在膜或芯片 u与RT- PCR扩增的病毒产物进行杂交 u是建立在5非编码区基础上 u有5% 10%的1 a、1 b 型不能鉴别, u也不能区别2 a 和2 c 型。 uStuyver L，Wyseau A，Maertens G，et al. Second generadon line probe assay for hepatim C virus genotyping Jjourhal of Clinical Microbiology，1996；34：2259 uHCV genotypes in Northern Italy: a survey of 1368 histologically proven chronic hepatitis C patients ( 4)限制性片段长度多态性分析( RFLP)法: u用能识别特定酶切位点的限制性内切酶将 PCR 扩增的片段切割成不同长度的片段 u该方法常用的酶为HaeIII、RsaI 、Mva I 、Hinf I、Scrf I u该方法检测基因型的精确度为97 u不能区分所有的HCV基因亚型 u也不能识别在泰国和越南发现的变异基因 型， uDavidson F, Simmonds P, Ferguson JC, et al. Survey of major genotypes and subtypes of hepatitis C virus using RFLP of sequences amplified from the 5non -coding region. J Gen Virol, 1995, 76:1197-1204. ( 5)遗传发育关系进化树 u对一定区域的样本测序结束后可将序列互 相比较 u分析样本间序列的进化距离, 画出该区域内 HCV 流行的关系进化树, u观察HCV 在区域内的分子流行情况及特点 （6）特异引物错配延伸法(PSMEA) ： u利用taq酶在引物3末端发生错配时无法继 续延伸 u借助荧光测量仪检出错配峰出现的频率达 到分型目的 u该方法成为检测混合HCV基因型感染的方 法比直接测序灵敏度高20倍 uAntonishyn NA, Ast VM, McDonald RR. et al.Rap id genotyping of hepatitis C virus by primer- specific extension analysis J. Clin Microbio,l 2005, 43: 5158- 5563. （7）异源分子迁移率法（HMA）： u用已知不同型的HCV 参比DNA 与未知基 因型的HCV 的DNA 分子混合、变性、退 火, 形成同源、异源分子, u这些分子在PA GE 中迁移率不同, 并同异 源DNA 中不同碱基的数目成比例, 来鉴定 基因型 王林, 徐东平, 张灵霞. 丙型肝炎病毒基因型分型及临床意义 J. 肝脏2006, 12: 416- 417. （8）COMA基因分型法： u原理是基于长异源双链的解链特性不同 用已知的序列顺序的参考DNA捕获液相中 未知的DNA u两者形成异源双链杂交体，由这个杂交体 的两条单链间解链曲线的差异可以推断出 其序列差异 uGenotyping HIV-1 and HCV strains by a combinatorial DNA melting assay (COMA).Kostrikis LG et al. Mol Med. (1998) （9）Taqman探针实时PCR测试法 u这一方法用到了Taqman探针(针对5 UTR) u结合荧光实时PCR M Lindh，Harmoun CGenotyping of hepatitis C virus by Taqman realtime PCIKJournal of Clinical V