红细胞免疫功能测定方法.ppt

红细胞免疫功能及其测定方法 汇报人：王 翀 在肿瘤的发生发展过程中免疫功能起着重要的作用，过去 的观点认为免疫功能主要和白细胞有关，而红细胞在其中 所起的作用一直未受重视。1981年siegel提出了红细胞免疫 系统的新概念，开辟了机体免疫功能研究的新纪元。红细 胞作为人体血液有形成份的主要组成部分与肿瘤细胞的接 触机会比其他细胞要大1000倍。红细胞可以通过促吞噬作 用、清除循环免疫复合物( CIC )、效应细胞样作用及对淋巴 细胞和细胞因子的调控作用来达到抑制肿瘤的生长和转移 的作用。在正常情况下，红细胞免疫和白细胞免疫(如T细 胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞)在机体内相互联系、密切 配合、协同作战，识别和清除肿瘤细胞，共同维持机体内 环境的平衡和生物功能的稳定。 1 红细胞与其它免疫反应细胞的比较 n红细胞与其它血细胞均来源于骨髓造血干细胞 。以往认为虽然它们来源相同，但功能各异， 前者主要是运输气体，而后者则参与免疫和防 御机制。目前研究表明，红细胞不仅具有呼吸 功能，且同白细胞一样具有免疫功能。 2 红细胞的免疫功能 2.1 增强吞噬作用 纳尔逊(Nelson)用肺炎球菌和梅毒螺旋体等进行体外实 验，发现被相应抗体致敏的肺炎球菌或梅毒螺旋体， 只有在含补体、红细胞及白细胞的混合物中，80 95能迅速被吞噬而从液相中消失；若缺少红细胞， 则在较长时间内仅有少数被吞噬。1956年Nelson又将抗 体调理过的肺炎球菌注入猴体内，获得的结果与体外 实验相同，100的肺炎球菌粘附于红细胞。 n粘附的复合物较悬浮于血浆中游离的复合物更易被吞噬 。某些病毒在体内也能粘附于红细胞，从而被吞噬消灭 。免疫粘附可以增强吞噬作用45倍。红细胞还能阻止 癌细胞在循环中播散，因在外周血中癌细胞遇到红细胞 比遇到白细胞的机会多5001000倍。当癌细胞表面结 合有抗体与补体时，则可通过红细胞表面的C3b受体， 使癌细胞粘附于红细胞，故容易被吞噬细胞捕捉与吞噬 ，从而防止癌细胞的转移与扩散。 n红细胞还有吞噬细胞样的功能，因为在其细胞膜表面具 有过氧化物酶，该酶是典型的溶酶体酶，它可起着巨噬 细胞样的杀伤作用。 2.2 红细胞的免疫粘附作用 n免疫粘附是指抗原-抗体复合物与补体C3b结合后，可粘 附于灵长目或非灵长目的红细胞与血小板上，这一现象 统称为“血细胞免疫粘附作用”。红细胞的免疫粘附活性 是通过I型补体受体（complement receptor type I，CR1 ) 为基础实现的。血循环中免疫复合物( IC )的清除主要由 红细胞CR1携带至肝脾网状内皮系统交给巨噬细胞消灭 。CR1成簇分布，人类每个红细胞大约表达200500个 CR1分子，主要配体为C3b。该受体为糖蛋白，分子量 为205 ，000。红细胞上的C3b受体占血循环中C3b受体 总数的95以上。因此，血循环中的抗原-抗体复合物遇 到红细胞比遇到白细胞的机会多5001 000倍。 2.3 防御感染 n红细胞与细菌、病毒等微生物免疫粘附后，不仅可以通 过过氧化物酶对它们产生直接的杀伤作用，而且还可以 促进吞噬细胞对它们的吞噬作用。因此，红细胞的免疫 功能可以看作是机体抗感染免疫的因素之一。 n小结：目前已知红细胞具有以下免疫功能：(1)识别携带 抗原；(2)清除循环中免疫复合物；(3)增强T细胞依赖反 应；(4)效应细胞样作用；(5)促进吞噬作用。而这些免疫 功能的生理学基础即为红细胞免疫粘附作用。 3 红细胞免疫功能异常与疾病 n近年研究证实在某些病理状态下，红细胞的免疫粘附活 性可发生改变。Siegel等检查了23名宫颈癌、胃癌和直 肠癌患者的红细胞免疫粘附功能，发现这些患者的红细 胞粘附抗原-抗体-补体复合物的能力较正常人显著降低 。这一资料提示在肿瘤的发展过程中，除可抑制白细胞 免疫功能外，还可抑制红细胞的免疫功能。 n系统性红斑性狼疮（SLE）、类风湿性关节炎等自身免 疫性疾病，是因为患者体内针对自身组织发生免疫反应 所致。一般认为，自身免疫病患者的细胞免疫和/或体液 免疫功能处于相对增强状态。通过对此类病人红细胞免 疫系统的研究结果表明，其免疫功能亦明显增强，且与 白细胞免疫系统的功能改变相平行，这可能与自身免疫 病患者血清中存在着红细胞C3b受体活性抑制因子有关 。 n目前认为原发性癫痫和银屑病的发病也与自身免疫有关 。郭峰等曾观察到这两种疾病患者的红细胞免疫功能的 变化与 SLE 等其它自身免疫病患者是一致的。 n另外，再生障碍性贫血的患者，其红细胞的免疫粘附作 用降低，可能是由于患者造血功能障碍，所产生的红细 胞数量少而且质量低劣，致使红细胞膜上的C3b受体生 成不足。慢性布氏菌病患者，其红细胞免疫功能亦降低 ，致使清除感染因子的能力减弱，这种现象可能是引起 该病经久不愈的原因之一。 4 红细胞免疫功能的检测及其临床意义 4.1 红细胞C3b受体的测定 n原理：红细胞膜上的C3b受体(CR1)可与补体致 敏的酵母菌粘附形成花环( RBC-C3bR花环 )；同 时红细胞膜上粘附的IC中C3b分子或抗原补体复 合物中的C3b分子可与未致敏的酵母菌的酵母多 糖粘附形成花环（ RBC-IC花环 ）。 n意义：RBC-C3bR花环率和RBC-IC花环率可作为红细胞 天然免疫粘附功能的指标。 （1）若两项指标都低下，判为原发性红细胞免疫功能低下 ，为红细胞膜C3b受体受到破坏或遗传基因缺陷及其他 影响所致。 （2）若RBC-C3bR花环率降低，而RBC-IC花环率增高，则 为继发性红细胞免疫功能低下，是由于红细胞CR1上免 疫复合物或补体调理的抗原量增加所致。 （3）若这两项指标都上升，判断为红细胞天然免疫功能亢 进与紊乱。 4.2 红细胞CR1数量的测定 4.2.1 红细胞CR1密度相关基因多态性测定方法 DNA提取 PCR扩增 限制性片段长度多态性酶切分析（RFLP分析） 琼脂糖凝胶电泳 4.2.2 红细胞CR1流式细胞仪测定方法 n原理：单个红细胞CR1数量比白细胞CR1低，为 了提高试验的敏感度，采用间接免疫荧光染色 法流式细胞仪检测技术。用鼠抗人红细胞CR1单 抗与一定量待测纯红细胞数反应洗涤，再加羊 抗鼠IgG荧光标记抗体反应洗涤后，上流式细胞 仪测定，算出荧光染色红细胞平均强度，为红 细胞CR1数量指标。 n具体操作程序： 在编号试管中分别加冷PBS 50 l，加入鼠抗人红细胞 CR1(CD35)单抗1.5 l及待测枸橼酸钠抗凝新鲜血0.5 l ，充分吹打混匀，置室温下避光30 min。加入PBS液2 ml ，1500 r/min 离心5 min，弃上清液；加入荧光素标记的 第二抗体 羊抗鼠IgG-FITC 1 l，吹打混匀，置室温 下避光30 min；再加入PBS液2 ml，充分混匀、洗涤， 1500 r/min 离心5 min，弃去上清夜后加入PBS 300 l， 混匀后置流式测试管中，严格按照流式细胞仪操作程序 测定样品和对照品，在计算机屏幕上显示或记录各待测 标本红细胞平均荧光强度。 n意义：红细胞CR1数量流式细胞仪测定结合CR1基因多 态性及红细胞CR1活性测定，对临床上红细胞免疫功能 缺陷与亢进分型更为客观，对临床辅助诊断及疗效指标 都具有重要应用价值。 4.2.3 红细胞CR1单抗免疫酶联法（ELISA法） 5 正常红细胞与异常红细胞毛细管电泳分离 n能直接反映颗粒电性质的毛细管电泳具有高效、简便、 灵敏度高、样品消耗少等优点，在生化领域已经广泛应 用于蛋白质及其衍生物、肽类、氨基酸、糖类物质、无 机离子、手性物质等的分离与分析。 n运用毛细管电泳的方法可以对正常红细胞和被病毒感染 的异常红细胞进行比较，以此来反映鉴定不同状态的细 胞。 n样品制备 1) 正常红细胞悬浮液 用含6%葡萄糖的0.1mol/L， pH 7.4的磷酸盐缓冲液稀释 红细胞，通过血球板计数法，确定细胞浓度为1.86107 个/ mL。 2) 异常红细胞悬浮液 取上述浓度红细胞0.2 mL与H1N1甲亚型流感病毒0.02 mL充分混合，常温(25)下反应1。 n电泳条件 每天运行前用0.1 mol/L HCl、0.1 mol/L NaOH、水、缓 冲液分别洗柱3、6、3、3 min；每轮运行前均用0.1 mol/L NaOH 、水、缓冲液分别洗柱3、1、1 min；结束 实验时用0.1 mol/L HCl 、 0.1 mol/L NaOH和水分别洗 柱5、10、5 min，最后将毛细管内壁吹干保存。正极进 样，负极检测，均在室温下进行。进样压力3.448 kPa ，进样时间5 s；分离电压20 kV；紫外检测波长214 nm ；分离温度25。 n感染病毒后，在病毒作用下红细胞表面荷电量 会发生改变，致使细胞电泳速度和zeta电位发生 改变。实验证明，被病毒感染的红细胞与正