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第一讲第一讲 发酵工程发酵工程 概述概述 张惟广 西南大学食品学院 参考书目： 姚淑华：微生物工程工艺原理，华南理工大学出版社 刘如林：微生物工程概论，南开大学出版社 谭天伟：生物分离技术，化学工业出版社 于龙江：发酵工程原理与技术应用 贾仕儒：发酵工程 田洪涛 张惟广食品发酵工程学 发酵工程概念 采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功 能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生 产过程中的一种新技术。 以生命科学为基础 结合先进的工程技术手段和其它自然科学原理按照预 先的设计改造生物体 利用微生物、动物或植物体对原料进行加工 生产出人类所需产品或达到某种目的的技术 发酵工程的内容 在以下步骤中需要解决的问题还很多： 菌种的选育 培养基的配制 灭菌 扩大培养和接种 发酵过程 分离提纯 本课程的学习目的 通过发酵工程的学习，将技术基础课和专业课与发酵工业的操 作原理结合起来，了解发酵工业控制的特性及共性，并且熟悉发酵工 业的工艺流程及常用术语，为今后从事生物工程的有关科研和生产打 下良好的基础。 此外，发酵工程的最基本问题是过程优化与放大，通过本课程的学 习，对上述过程工程问题与生物学基础有较深入的认识，对有关交叉学 科的前沿技术在发酵工程中的应用有一定的了解。 发酵工程 在生物技术产业发展中的地位 21世纪的工业生物技术产业，究竟是一个什么样的格局？ 核心发酵工程，在已经开始的生物经济时代/是处于一种什么状态？ 能起何种作用？ 又面临那些课题？ 这是人们所关注的问题！ 20世纪人类的三大创举？40年代原子弹、60年代登月、90年代的人类基因组计划 -19世纪：细胞学说、进化论、 能量守恒 预备知识 发酵现象的产生 一 发酵与酿造的概念 二 发酵的历史 三 发酵工业的范围 四 方法与流程 五 展望 天然发酵阶段-史前-1900 纯培养技术的建立-19051940 通气搅拌发酵技术-1940 非食品 代谢发酵控制技术-1957- 开拓发酵新原料-1960- 基因工程阶段-1979- 微生物细胞 代谢产物 酶 微生物的转化乙醇-乙酸、甾体-可的松、 废水处理 厌氧和有氧发酵 液体和固体发酵 分批和连续发酵 菌种、活化、扩大、种子、发酵、分离、产品 发酵现象酿造食品工业非食品工业青霉素抗菌素发酵工业氨基酸,核酸发酵（代谢控制 发酵）基因工程菌动物细胞大规模培养植物细胞大规模培养藻类细胞大规模培养转基因动物 发酵工业的分类 酿酒业（啤酒、葡萄酒、白酒）。 厌氧发酵 调味品（酱油、醋）。 好氧发酵 酵母工业自然发酵。 氨基酸发酵典型的代谢控制发酵。 抗菌素发酵次级代谢控制发酵。 酶制剂工业具有重要的意义，是工业发展的基础、科学 研究的基础 有机酸工业柠檬酸、葡萄酸、乳酸、琥珀酸等。 石油发酵降低石油熔点（石油脱腊） 有机溶剂工业 乙醇、丙醇等 维生素发酵VC、VB2 生理活性物质白介素2 环境工业废水的生物处理，废弃物的生物降解 微生物发酵的基本特征 1.微生物发酵过程是一个典型的化工过程 质量的传递氧的供给、代谢物的排泄等 热量的传递微生物呼吸产热，微生物生长于代谢需要稳定的而严格的温度条 件。 动量的传递涉及到搅拌轴功率的计算，他与溶氧、气液混合的关系 微生物的反应工程涉及到微生物的生长动力学模型的建立，产物生成动力学 模型的建立。 2.微生物发酵过程是一个典型的代谢控制发酵 从微生物发酵的历史角度看，最早的微生物发酵是一个自然发酵过程，现代微生物 工业通常是指微生物的代谢控制发酵？ 定义：是指利用生物的、物里的、化学的方法，人为的改变了微生物的生长代谢途 径，使之合成、积累、分泌我们所需要的产品的过程。 3.微生物发酵工业又是一个有别于化工过程的一个工业，有以下几个特征： 反应条件温和 通常由于微生物的生理特性，要求温度为30-40 pH值中性偏酸性酵母、霉菌、放线菌等 pH值中性偏碱性细菌的发酵 无菌发酵 非连续性生产 微生物的生理特性决定了发酵过程的非连续性可实现部分连续啤酒、酒精 发 酵 与 现 代 生 物 工 程 基因工程 酶工程 细胞工程 发酵工程 产物 产品 产品 返回 Figure 1. Idealized biorefinery concept. (Image courtesy of Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN, USA.) 微生物产物： 微生物细胞，酶，药物活性物质，特殊化学物质和食品添加剂 发 酵 工 程 利用微生物进行产品生产 抗生素、生物制药、氨基酸、核苷酸、 有机酸、饲料添加剂、微生态制剂、 生物农药、生物肥料等 医药、轻工、食品、农业、环保、能源等行业 基因工程药物、疫苗及抗体产品 化学工程化学工程 生物化工生物化工 生物加工行业生物加工行业 传统生物技术传统生物技术 现代生物技术现代生物技术 基因工程菌发酵 发酵罐示意图 认识过程 概念：微生物（microorganism、microbe）不 是生物分类学上的名词，是一切肉眼看不见或看不 清楚的微小生物（ 0.1mm）的总称。大多数在 几微米到几十微米。 特性：个体小、外贸不显、杂居混生、因果难 联 困惑：视而不见、嗅耳不闻、触而不绝、食而 不察、得其益而不感其好、受其害而不感其恶。 例 证 6世纪（542年）鼠疫世界性爆发：从拜占廷帝国延地中海传入，涉及土耳 其、埃及、意大利、阿富汗等，死亡1亿人 14世纪（1347-1350)鼠疫世界性爆发：欧洲死亡0.25亿、亚洲0.5亿（中0.13 ） 19世纪末(1894)：香港和印度死亡100万 1817-1999: 七次霍乱，天花、疟疾、白喉等。和战争贸易有关 1918年：西班牙流感，死亡5000万人。类似于今天的H1N1 病毒。 冰下分离病毒蛋白自然2005-10-06 19世纪中叶马铃薯晚疫病：毁灭欧洲80%的产量。 长期未解决的葡萄酒、啤酒的变酸 等 SAAS在中国的肆虐 1878年开始有报道，禽流感的频发等 中国对微生物学的贡献 8000-5000年前：中国的酒曲第五大发明。 公元前2世纪：清醠之美，始于耒耜si 若作酒醴，尔唯曲蘖。 东汉华佗药酒麻醉剂 北魏贾思勰533-544齐民要素、宋朱肱北山酒经、明宋应星1637年天工开物 酒之所兴，肇自上皇，一曰仪狄，或曰杜康。 有饭不尽，委于空桑，郁积成味，久蓄气芳。本出于此，不由奇方。 2500年前：麦曲治疗腹病酶制剂 、用发霉的豆腐或面包溃疡和化脓 900年前：自养细菌冶金胆水浸铜 18世纪初：人痘治疗天花，比E.Jenner早（德） 1892年，（法）A.Calmette小曲分离Mucor rouxianus提出阿明诺法- AmyloProcessing 发酵的威力：升酵母发酵液的细胞表面积为M2 53年5月第一次试制成功青霉素 微生物的科学发展 1676年列文虎克（Holand,Anthony van Leeuwenhoek,1632-1723）单式显 微镜的制作：放大50-266倍，认识微生物，发表论文400 L.Pasteur（F.1822-1895）的奠基：根据曲颈瓶实验建立了配 种学说（germ theory）, 认识了酒变酸的现象，揭示了微生物和酶发 酵的本质，提出酒变酸、肉变坏、痰阻病、狂犬病、霍乱的微 生物基础和建立杀菌方法-pasteurization 。 R.Koch (G.1843-1910)发展: 划线培养，分离了炭疽、霍乱、 结核菌，提出了柯赫法则（Kochs Postulates） E.Buchner(G.): 1897年验证酒化酶（zymase）的存在 成熟期：53年4月25日 Watson and Crick 发表DNA双螺 旋 1. 巴斯德的工作 (1) 发现并证实发酵是由微生物引起的 (2) 彻底否定了“自然发生”学说 (3) 免疫学预防接种 (4) 其他贡献：巴斯德消毒法等 2. 柯赫的工作 (1) 微生物学基本操作技术方面的贡献 a） 细菌纯培养方法的建立 b） 配制培养基 c） 流动蒸汽灭菌 d） 染色观察和显微摄影 （2） 对病原细菌的研究作出了突出的贡献： a） 具体证实了炭疽病菌是炭疽病的病原菌。 b） 发现了肺结核病的病原菌 c） 证明某种微生物是否为某种疾病病原体的基本原则柯赫原则 1 在每一病例中都出现这种微生物； 2 要从寄主分离出这样的微生物并在培养基中培养出来； 3 用这种微生物的纯培养接种健康而敏感的寄主，同样的疾病会重复发生； 4 从试验发病的寄主中能再度分离培养出这种微生物来。 发酵技术的发展 传统技术：酒、酱、泡菜、奶酒、蜜酒、干酪 第一代嫌气初级代谢产物（19世纪末20世纪30年代）： 乳酸、酒精、面包酵母、有机酸、酶制剂等 通气代谢发酵年代：29年青霉素问世，发酵 罐、通气理论的完善，抗生素，有机酸，酶、维生素等 单细胞蛋白年代：大罐、连续发酵5003000 吨 基因工程以后： 胰岛素，干扰素等 1972年美国斯坦福大学的伯格第一次重组DNA获得成功 ,伯格因此获得了19801980年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖。 转基因 Berg博士 显微镜下的DNA分子 所谓转基因产品又称基因改良产品，是指利用基因工程 技术将一种微生物、动物或植物的基因植入另一种微生物、 动物或植物中，改变原有生物的基因组，制造出具备新特征 的产品，从而使该产品获得它所不能自然拥有的品质。 世界上首例基因移植作物是 英国1983年培植出的一种含 抗生素药类抗性的烟草。 两种态度 - 一种是：携带着一种具有潜在危险 的克隆基因，有可 能因偶然的机会，寄生在 人的肠道中，而导致某种灾难性的后果。 - 另一种：自然界中的生物腐烂尸体 所释放出来的DNA肯定会有机会被其他生物 所捕获，基因重组在自然界中是自发进行的 ，自然界同时对变异的物种进行着选择。 80年代 以来，利用基因技术已批量生产出 抗虫害、抗病毒、抗杂草的转基因玉米、黄豆、油菜、土豆、西葫芦等。 - 1998年，英国科研人员公布了一份研究报告：转基因马铃薯喂养大鼠，发现大鼠 器官生长异常，免疫系统遭到破坏。之后，英国皇家学会评审中，对试验的严谨性提出了 质疑。 - 2002年，英国“nature”和美国的“science”杂志又陆续报道了转基因食品中的 DNA片断可以进入人体肠道中的菌体内部，这个结果似乎可证明肠道中的菌群会获得抗性 基因而具有抗性。 - 美国的孟山都公司M onsanto（孟山都是最大的一个，他的资本渗透到 许多转基因食品公司）他们的一份未公开的研究报告显示，转基因玉米可引起大鼠肾脏发 育不良，免疫力下降等。老鼠肾脏变小，血液的构成发生变化 转基因产品安全性涉及的内容 转基因的逃逸：转基因逃逸就是转入基因 向野生近源物种流动。逃逸的途径主要有两种 - 第一种是转基因植物腐烂后DNA残留被近源植物、 微生物所捕获，而具有了某种特性（转基因特性）。 - 第二种途径：转基因植物花粉的飘飞。 超级杂草 DNA释 放田间 抗除草剂转基因植株 腐烂 非转基因 植物捕获 转基因产品安全性涉及的内容 食品过敏： 过敏是免疫系统对特殊蛋白产生的一种反应。 转基因食品中含有新基因所表达的新蛋白，有些 可能是致敏原，有些蛋白质在胃肠内消化后的片段也可能 有致敏性。 过 敏 反 应 过敏原进入体内 转 基 因 产 品 转基因产品安全性涉及的内容 病毒重组： 抗病毒转基因产品所用的外源基因和载 体大多来源于病毒基因，这样会造成当病毒侵入转 基因植物后，发生基因重组，产生新的病毒，产生 变异，或产生新病毒。 植物病毒 被侵染的转基因植物 重组变异病毒 转基因产品的安全性目前仍是前途未卜 许多政府都采取了一些折中的做法将转基 因产品贴上标识，选择权留给消费者。 - 强制性：欧盟15国及澳大利亚、新西兰、巴西 、中国、加拿大、中国香港、日本、俄罗斯、韩国、瑞士等 40多个国家或地区。 - 自愿性：美国、加拿大、俄罗斯、阿根廷等。 发酵液的分离技术 发酵液的预处理 一改变发酵液的过滤和沉降特性 二发酵液的相对纯化 发酵醪与菌体的分离（固液分离）技术 一过滤分离技术 二离心分离技术 三其他固液分离技术 细胞破碎技术 一物理破碎技术 （包括：高速珠磨破碎技术；高压均质破碎技术；超声波破 碎技术等） 二化学破碎技术 （包括：酸热技术；化学渗透技术等） 三生物酶溶技术 四其他破碎技术 五细胞破碎率的测定与破碎技术的发展方向 发酵液的分离技术 发酵产物的提取技术 一沉淀提取技术 （包括：有机溶剂沉淀技术；盐析沉淀技术；等电点沉淀技术 ；金属离子沉淀技术；聚电解质沉淀技术；非离子型聚合物沉淀技 术等） 二吸附提取技术 （包括：活性碳疏水性吸附技术；硅胶、氧化铝等亲水性吸附 技术；树脂吸附技术） 三萃取技术-作业 、电泳分离等电、毛细 （包括：有机溶剂萃取技术；双水相萃取技术；反胶束萃取技 术；液膜萃取技术；液固萃取浸取技术；超临界流体萃取技术 ） 四蒸馏技术 发