[理学]第四章 核酸.ppt

第 四 章 核 酸 l核酸与蛋白质一样，是一切生物机体不 可缺少的组成部分。 l核酸是生命遗传信息的携带者和传递者 ，它不仅对于生命的延续，生物物种遗 传特性的保持，生长发育，细胞分化等 起着重要的作用，而且与生物变异，如 肿瘤、遗传病、代谢病等也密切相关。 l因此，核酸是现代生物化学、分子生物 学和医学的重要基础之一。 核酸与遗传 l早在1868年，F. Miescher从细胞核中分 离得到一种酸性物质，即现在被称为核 酸的物质。 l1939年，E. Knapp等第一次用实验方法 证实核酸是生命遗传的基础物质。 1928年，英国 Griffith S型肺炎球菌：有荚 膜，菌落表面光滑 R型肺炎球菌：没有 荚膜，菌落表面粗糙 什么是遗传物质 n 著名的肺炎球菌实验 结果说明？结果说明？ l 结果说明：加热杀死的S型肺炎球菌中一定有某种 特殊的生物分子或遗传物质，可以使无害的R型肺 炎球菌转化为有害的S型肺炎球菌 l 这种生物分子或遗传物质是什么呢？ n 著名的肺炎球菌实验 纽约洛克非勒研究所纽约洛克非勒研究所 Avery Avery 从加热杀死的从加热杀死的S S型肺炎球菌将蛋白质、核酸、多型肺炎球菌将蛋白质、核酸、多 糖、脂类分离出来，分别加入到无害的糖、脂类分离出来，分别加入到无害的R R型肺炎型肺炎 球菌中，球菌中， 结果发现，惟独只有核酸可以使无害的结果发现，惟独只有核酸可以使无害的R R型肺型肺 炎球菌转化为有害的炎球菌转化为有害的S S型肺炎球菌。型肺炎球菌。 19441944年年 结论：结论：DNADNA是生命的遗传物质是生命的遗传物质 1952年，Hershey 和 Chase 病毒（噬菌体） 放射性同位素35S标记病毒的 蛋白质外壳，32P标记病毒的 DNA内核，感染细菌。 新复制的病毒，检测到了32P 标记的DNA，没有检测到35S 标记的蛋白质， DNA在病毒和生物体复制或 繁殖中的关键作用。 8年的时间 n 更有说服力的噬菌体实验 n DNA双螺旋结构的发现 n1951年 Watson 23岁 n丹麦的哥本哈根 Wilkins教授 n英国剑桥大学Cavendish实验室 nCrick， 31岁 n伦敦大学Kings实验室 n女科学家Franklin nWilkins教授 Randall教授 nDNA应该是双螺旋 nA与T、 C与G巧妙连接 n符合X衍射数据 DNA的复制 n1953年2月28日，Watson 和Crick用金属线又制出了新的DNA 模型，他们为自然科学树立了一座闪闪发光的里程碑。 4.1 核酸的分类和组成 l核酸分为两大类 l脱氧核糖核酸（DNA） lDeoxyribonucleic Acid l核糖核酸（RNA） lRibonucleic Acid 一、一、核酸的分类 lDNA分子含有生物物 种的所有遗传信息 ，分子量一般都很 大。 lDNA为双链分子，其 中大多数是链状结 构大分子，也有少 部分呈环状结构。 脱氧核糖核酸（DNA） 核糖核酸（RNA） lRNA主要是负责DNA遗传信息的翻译和表 达，分子量要比DNA小得多。RNA为单链 分子。 RNA的类别 l根据RNA的功能，可以分为mRNA、 tRNA和rRNA三种。 mRNA (信使RNA) l约占总RNA的5%。 l不同细胞的mRNA的链长和分子量差异很 大。 l它的功能是将DNA的遗传信息传递到蛋白 质合成基地 核糖核蛋白体。 Messenger RNA tRNA (转移RNA) l约占总RNA的10-15%。 l它在蛋白质生物合成中起翻译氨基酸信 息，并将相应的氨基酸转运到核糖核蛋 白体的作用。 l已知每一个氨基酸至少有一个相应的 tRNA。 ltRNA分子的大小很相似，链长一般在73- 88个核苷酸之间。 lTransfer RNA rRNA (核糖体RNA) l约占全部RNA的80%， l是核糖核蛋白体的主要组成部分。 lrRNA 的功能与蛋白质生物合成相关。 Ribosome RNA 二 核酸的组成 l核酸（DNA和RNA）是一种线性多聚核苷酸，它 的基本结构单元是核苷酸。 l核苷酸本身由核苷和磷酸组成。 l而核苷则由戊糖和碱基形成。 lDNA与RNA结构相似，但在组成成份上略有不同 。脱氧核糖或核糖上第一位碳原子与嘌呤或嘧 啶结合，就成为脱氧核苷或核苷，第三位或第 五位碳原子再与磷酸结合，就成为脱氧核糖核 苷酸或核糖核苷酸。 l碱基+戊糖 l 核苷 + 磷酸 l 核苷酸 poly 聚合 l 核酸 l(核苷酸之间通过3,5-磷酸二 脂键连接) 碱基 戊糖 磷酸 DNA和 RNA中的碱基和糖的结构 1核苷酸 （1）组成核酸的碱基 DNA的碱基是 A、T、G、C ，RNA的碱基 是A、U、G、 C。 1核苷酸 （1）组成核酸的碱基 l鸟嘌呤Guanine 1 1核苷酸核苷酸 （1）组成核酸的碱基 l鸟嘌呤guaninel腺嘌呤Adenine 1核苷酸 （1）组成核酸的碱基 l尿嘧啶Uracil 1核苷酸 （1）组成核酸的碱基 l胞嘧啶Cytosine 1核苷酸 （1）组成核酸的碱基 l胸腺嘧啶Thymine 1核苷酸 碱基的结构特征碱基的结构特征 l碱基都具有芳香环的结构特征。嘌呤环 和嘧啶环均呈平面或接近于平面的结构 。 l碱基的芳香环与环外基团可以发生酮式 烯醇式或胺式亚胺式互变异构。 胺 式 亚 胺 式 互 变 异 构 酮 式 烯 醇 式 互 变 异 构 1核苷酸 碱基的结构特征碱基的结构特征 l嘌呤碱和嘧 啶碱分子中 都含有共轭 双键体系， 在紫外区有 吸收（260 nm左右）。 1核苷酸 （2 2）戊糖）戊糖 l组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为 -D-2-脱氧核糖；RNA所含的糖则为- D-核糖。 1核苷酸 （3 3）核苷）核苷 nucleosidenucleoside l糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键。 1核苷酸 （4 4）核苷酸）核苷酸nucleotidenucleotide l核苷酸是核苷的磷酸酯。作为DNA或RNA结构单元的核 苷酸分别是5-磷酸-脱氧核糖核苷和3-磷酸-核糖 核苷。 1核苷酸 (5)(5)修饰成分修饰成分 l核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。 稀有碱基的种类很多，大部分是上述碱 基的甲基化产物。 2核苷酸的衍生物 ATP是生物体内分布最广和最重要的一种核苷酸衍生 物。它的结构如下： （1 1） ATP (ATP (腺嘌呤核糖核苷三磷酸腺嘌呤核糖核苷三磷酸) ) ATP的性质 lATP 分子的最显著特点是含有 两个高能磷酸键。ATP水解时, 可以释放出大量自由能。 lATP 是生物体内最重要的能量 转换中间体。ATP 水解释放出 来的能量用于推动生物体内各 种需能的生化反应。 lATP 也是一种很好的磷酰化剂 。磷酰化反应的底物可以是普 通的有机分子，也可以是酶。 磷酰化的底物分子具有较高的 能量（活化分子），是许多生 物化学反应的激活步骤。 (2)GTP (鸟嘌呤核糖核苷三磷酸) lGTP是生物体内游离存在的另一种重要的核苷 酸衍生物。它具有ATP 类似的结构, 也是一种 高能化合物。 lGTP主要是作为蛋白质合成中磷酰基供体。在 许多情况下, ATP 和 GTP 可以相互转换。 （3）cAMP 和 cGMP lcAMP(3,5- 环腺嘌呤核苷 一磷酸)和 cGMP( 3,5-环 鸟嘌呤核苷一磷酸)的主要功 能是作为细胞之间传递信息的 信使。 lcAMP 和 cGMP 的环状磷酯键 是一个高能键。在 pH 7.4 条 件下, cAMP 和 cGMP 的水解 能约为43.9 kJ /mol，比 ATP 水解能高得多。 3多聚核苷酸 l多聚核苷酸是通过核苷酸的C5-磷酸基 与另一分子核苷酸的C3-OH形成磷酸二 酯键相连而成的链状聚合物。 l由脱氧核糖核苷酸聚合而成的称为DNA链 ； l由核糖核苷酸聚合而成的则称为RNA链。 多聚核苷酸的特点 l在多聚核苷酸中，两个核苷酸之间形成的磷 酸二酯键通常称为3 5磷酸二酯键。 l多聚核苷酸链一端的C5带有一个自由磷酸 基，称为5-磷酸端（常用5-P表示）； 另一端C3带有自由的羟基，称为3-羟基 端（常用3-OH表示）。 l多聚核苷酸链具有方向性，当表示一个多聚 核苷酸链时，必须注明它的方向是53 或是35。 方向性 l在多聚核苷酸（DNA或RNA）链 中，由于构成核苷酸单元的戊 糖和磷酸基是相同的，体现核 苷酸差别的实际上只是它所带 的碱基，所以多聚核苷酸链结 构也可表示为： l在讨论有关核酸问题时，一 般只关心其中碱基的种类和 顺序，所以上式可以进一步 简化为： l 5PAPCPGPCPTPGPTPA 3 l 或5 ACGCTGTA 3 作业 l记忆6个重要碱基的结构和缩写。 l写出 ATP,GTP,UDP,CMP,TTP的结构。 第二节 核酸的结构 l一、核酸的一级结构 l多聚核苷酸是由四种不同的核苷酸单元按特定的顺序 组合而成的线性结构聚合物，因此，它具有一定的核 苷酸顺序，即碱基顺序。 l核酸的碱基顺序是核酸的一级结构。 lDNA的碱基顺序本身就是遗传信息存储的分子形式。生 物界物种的多样性即寓于DNA分子中四种核苷酸千变万 化的不同排列组合之中。 l而mRNA(信息RNA)的碱基顺序，则直接为蛋白质的氨基 酸编码，并决定蛋白质的氨基酸顺序。 一、一、DNADNA的一级结构的一级结构 一级结构：各核苷酸残基沿多核苷酸链排列一级结构：各核苷酸残基沿多核苷酸链排列 的顺序。的顺序。 1 1、读向：从左到右、读向：从左到右 2 2、方向：、方向： 53 3 3、连接键：、连接键： 3 5磷酸二酯键 DNADNA一级结构一级结构 5-磷酸 3-羟基 碱基 脱氧核糖 一、一、DNADNA的一级结构的一级结构 二、DNA的二级结构 l1953年，J. Watson和 F. Crick 在前人研究 工作的基础上，根据 DNA结晶的X-衍射图谱 和分子模型，提出了 著名的DNA双螺旋结构 模型，并对模型的生 物学意义作出了科学 的解释和预测。 二、二、DNADNA的二级的二级 结构结构 理论根据：理论根据： 1 1、碱基组成的定、碱基组成的定 量分析。量分析。 2 2、DNADNA纤维进行纤维进行X X - -衍射分析：不同衍射分析：不同 来源的来源的DNADNA分子有分子有 相似的图谱；沿相似的图谱；沿 纤维长轴有周期纤维长轴有周期 性变化。性变化。 ChargaffChargaff定律：定律： A=T； G=C； A+C=T+G ； A+G=T+C。 所有DNA中碱基组成必定 是A=T；G=C，这一规律 暗示A与T，G与C相互配 对的可能性，为双螺旋 结构的提出提供了重要 根据。 1DNA双螺旋结构的特点 lDNA分子由两条DNA单 链组成。 lDNA的双螺旋结构是 分子中两条DNA单链 之间基团相互识别和 作用的结果。 l双螺旋结构是DNA二 级结构的最基本形式 。 DNA双螺旋结构的要点 l（1）DNA分子由两条多聚脱氧核糖核苷酸链(简 称DNA单链)组成。两条链沿着同一根轴平行盘 绕，形成右手双螺旋结构。螺旋中的两条链方 向相反，即其中一条链的方向为53，而 另一条链的方向为35。有共同的螺旋轴 ，螺旋平面有大沟和小沟之分。 l（2）嘌呤碱和 嘧啶碱基位于螺 旋的内侧，磷酸 和脱氧核糖基位 于螺旋外侧。碱 基环平面与螺旋 轴垂直，糖基环 平面与碱基环平 面成90角。 DNA双螺旋结构的要点 l（3）螺旋横截面的直径 约为2 nm，每条链相邻 两个碱基平面之间的距 离（碱基堆积距离）为 0.34 nm（实测0.33nm） ，相邻核苷酸彼此相差 36度。每10对核苷酸形 成一个螺旋，其螺矩（ 即螺旋旋转一圈）高度 为3.4 nm。 DNA双螺旋结构的要点 DNA双螺旋结 构的要点 l（4）两条DNA链相互结合 以及形成双螺旋的力是链 间的碱基对所形成的氢键 。碱基的相互结合具有严 格的配对规律，即腺嘌呤 （A）与胸腺嘧啶（T）结 合，鸟嘌呤（G）与胞嘧 啶（C）结合，这种配对 关系，称为碱基互补。A 和T之间形成两个氢键，G 与C之间形成三个氢键。 l在DNA分子中，嘌呤碱基 的总数与嘧啶碱基的总数 相等。 双螺旋的 几种形式 目前已知几种不同 形式DNA 2DNA双螺旋的稳定性 lDNA双螺旋结构在生理条件下是很稳定的。 l维持这种稳定性的因素包括：两条DNA链之间 形成的氢键；由于双螺旋结构内部形成的疏水 区，消除了介质中水分子对碱基之间氢键的影 响；介质中的阳离子（如Na+、K+和Mg2+）中和 了磷酸基团的负电荷，降低了DNA链之间的排 斥力、范德华引力等。 l改变介质条件和环境温度，将影响双螺旋的稳 定性。 稳固DNA双螺旋的作用力 l碱基堆积力 lH键 l离子键 DNA的存在形式 染色体与DNA的关系 l能够有效地解释遗传信息的储存、传送和自我 复制。 l提出了遗传信息的流动过程 。 复制DNA 转录RNA 翻译蛋白质 DNADNA双螺旋模型的意义双螺旋模型的意义 三、三、DNADNA的三级结构的三级结构 主要发现于：病毒、线主要发现于：病毒、线 粒体、叶绿体上。粒体、叶绿体上。 有：开环状、闭环超螺有：开环状、闭环超螺 旋、发夹型、线团状旋、发夹型、线团状 DNADNA分子的结构特征分子的结构特征 l原核生物DNA分子中 有基因重叠现象 l真核生物DNA分子中 普遍存在非编码顺序 (内含子) l编码的核苷酸顺序携 带着遗传信息 ATGCCGAGTCAGACTACGA GENE1 GENE2 插入顺序编码区 DNA:ACGTGGCCAGCC Thr TrpPro AlaAA: RNARNA的结构的结构 l单链 l局部碱基能配 对形成双螺旋 ，不能配对的 区域形成突起( 环) RNA一级结构的特点 lRNA一级结构研究最多的是 tRNA、rRNA以及一些小分 子的mRNA。其中 ltRNA分子具有以下特点： l分子量2.5万左右，大约由 7090个核苷酸组成，沉 降系数为4S左右。 l分子中含有较多的修饰成 分。 l3-末端都具有CpCpAOH的 结构。 tRNA的高级结构 l1，tRNA的二级结构 ltRNA的二级结构都呈“ 三叶草” 形状，在结 构上具有某些共同之处 ，一般可将其分为四臂 四环：包括氨基酸接受 区、反密码区、二氢尿 嘧啶区、TC区和可变 区。除了氨基酸接受区 、可变区外，其余每个 区均含有一个突环和一 个臂。 (1)氨基酸接受区 包含有tRNA的3-末端 和5-末端， 3-末端 的最后3个核苷酸残基都 是CCA，A为核苷。氨基 酸可与其成酯，该区在 蛋白质合成中起携带氨 基酸的作用。 (2)反密码区 与氨基酸接受区相对的 一般含有7个核苷酸残基 的区域，其中正中的3个 核苷酸残基称为反密码 子。 (3)二氢尿嘧啶区 该区含有二氢尿嘧啶。 (4) TC区 该区与二氢尿嘧啶 区相对， 假尿嘧啶核苷 胸腺嘧啶核糖核苷环(TC) 由7个核苷酸组成，通过由5 对碱基组成的双螺旋区(TC 臂)与tRNA的其余部分相连 。除个别例外，几乎所有 tRNA在此环中都含有TC 。 (5)可变区 位于反密码区与TC区之间 ，不同的tRNA该区变化较大 。 l四环四臂 laa臂与反密码 环是识别aa与 密码的重要结 构 tRNAtRNA的结构的结构 TC环 D环 反密码环 2,tRNA的三级结构 l在三叶草型二级结构的基础上，突环上 未配对的碱基由于整个分子的扭曲而配 成对形成三级结构，目前已知的tRNA的 三级结构均为倒L型。 mRNA一级结构的特点 l真核细胞mRNA的3 -末端有一段长达200个核 苷酸左右的聚腺苷酸(polyA)，称为 “尾结构 ” ，5 -末端有一个甲基化的鸟苷酸，称为 “帽结构” 。“穿靴戴帽” l大多数真核细胞mRNA在3 -末端有一段长约200 核苷酸的polyA。polyA是在转录后经polyA聚合酶 的作用而添加上去的。原核生物的mRNA一般无 polyA，但某些病毒mRNA也有3-polyA,polyA可能 有多方面功能,与mRNA从细胞核到细胞质的转移有 关；与mRNA的半衰期有关，新合成的mRNA, polyA 链较长，而衰老的mRNA，polyA链缩短。 lmRNA结构功能要点： l线形单链结构，携带DNA信息，作为指导合成蛋白 质的模板， l5端有甲基化结构， l3polyA尾结构， l半衰期短(几分钟到几小时)。 rRNA 真核细胞核糖体rRNA有四类：5SrRNA， 5.8SrRNA，18SrRNA，28SRNA。许多rRNA的 一级结构及由一级结构推导出来的二级结 构都已阐明，但是对许多rRNA的功能迄今 仍不十分清楚。 RNA的高级结构特点 lRNA是单链分子，因此，在RNA分子中， 并不遵守碱基种类的数量比例关系，即 分子中的嘌呤碱基总数不一定等于嘧啶 碱基的总数。 lRNA分子中，部分区域也能形成双螺旋结 构，不能形成双螺旋的部分，则形成突 环。这种结构可以形象地称为“发夹型 ”结构。 l在RNA的双螺旋结构中，碱基的配对情况 不象DNA中严格。G 除了可以和C 配对外 ，也可以和U 配对。G-U 配对形成的氢 键较弱。不同类型的RNA, 其二级结构有 明显的差异。 ltRNA中除了常见的碱基外，还存在一些 稀有碱基，这类碱基大部分位于突环部 分. rRNA mRNA tRNA 反密码子 氨基酸新生肽链 核糖体(rRNA+蛋白质） mRNA tRNA 作业 l概念：Chargaff（查加夫） 定律。 l 简述DNA双螺旋模型的要点。 l简述三种RNA的主要作用。 l写出以下核酸的结构式 ATTGC l一、一般性质 l 1. 性状 DNA 为白色类似石棉样的纤维状物 RNA为白色粉末或结晶 DNA 和RNA均为不对称大分子，长度与直 径之比可达107 l 2.溶解性质 都是极性化合物，易溶于水,都溶于2-甲 氧乙醇，但不溶于一般有机溶剂如乙醇、乙醚、 氯仿、戊醇和三氯醋酸。所以，常用乙醇做沉淀 剂，使其从溶液中析出。 脱氧核糖核蛋白（DNP）核糖核蛋白（RNP ） 易溶于水溶液中。 第三节、核酸的性质 l3 . 分子量 RNA和DNA的相对分子质量都很大，DNA 的相对分子质量比RNA的大。 RNA的相对分子质量大约从几万到几百 万或更大一些；DNA的一般在106-1010 l4.对碱的稳定性 DNA耐碱，RNA易被碱水解 l5.显色反应：鉴别DNA和RNA 浓HCl 浓HCl RNA - 绿色化合物 DNA - 蓝紫色化合物 苔黑酚 二苯胺 啡啶溴红（荧光染料）和溴嘧啶都可对DNA染色，原 理是卡在分子中，DNA的离心和电泳显色可用它们。 6.核酸的紫外吸收 l在核酸分子中，由于 嘌呤碱和嘧啶碱具有 共轭双键体系，因而 具有独特的紫外线吸 收光谱，一般在 260nm左右有最大吸 收峰，可以作为核酸 及其组分定性和定量 测定的依据。 l嘌呤碱基和嘧啶碱基是核酸中最重要的组分。 它们的性质对于核酸的性质和生物功能具有重 要影响作用。 l含氮碱基具有芳香环的结构特点。由于环上极 性基团（如羰基、氨基等）的存在，碱基能够 发生酮式-烯醇式或氨式-亚氨式的互变异构。 因此，碱基既有芳香环的特性，也具有氨、酮 和烯醇等相应的化学性质。 二、含氮碱基的性质 1，含氮碱基的碱性 l嘌呤碱基和嘧啶碱基都具有弱碱性。 l环内氨基的pKa值约为9.5。 l碱基环外的氨基（存在于A、G和C）的碱性很 弱，在生理pH条件下不能被质子化。这种情况 与苯胺分子中的氨基相似。 l因此嘌呤和嘧啶碱基的碱性主要是环内氨基的 贡献。 2,碱基环氮原子的烷基化反应 l在一定条件下，碱基环上的氮原子可以发生烷基化反 应。 l在同样条件下，U和T基本上不起反应。应用CH2N2 （叠 氮甲烷）作为烷基化剂，则所有碱基都能发生上述反 应。 三、核酸的性质 l1核酸的两性性质及等电点 l与蛋白质相似，核酸分子中既含有酸性基团（ 磷酸基）也含有碱性基团（氨基），因而核酸 也具有两性性质。 l由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸， 而碱性（氨基）是一个弱碱，所以核酸的等电 点比较低。如DNA的等电点为44.5，RNA的等 电点为22.5。 lRNA的等电点比DNA低的原因，是RNA分子中核 糖基2-OH通过氢键促进了磷酸基上质子的解 离，DNA没有这种作用。 2核酸的水解 l（1）酸或碱水解 l核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下 水解切断。 lDNA和RNA对酸或碱的耐受程度有很大差别。例 如，在0.1 mol/L NaOH溶液中，RNA几乎可以 完全水解，生成2-或3-核苷酸；DNA在同 样条件下则不受影响。这种水解性能上的差别 ，与RNA核糖基上2-OH的邻基参与作用有很 大的关系。在RNA水解时，2-OH首先进攻磷 酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯 ，再在碱的作用形成水解产物。 （2）酶水解 l生物体内存在多种核酸水解酶。这些酶可以催化水解 多聚核苷酸链中的磷酸二酯键。 l以DNA为底物的DNA水解酶（DNases）和以RNA为底物 的RNA水解酶（RNases）。 l根据作用方式又分作两类：核酸外切酶和核酸内切酶 。 l核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端（ 3-端或5-端）开始，逐个水解切除核苷酸；核酸 内切酶的作用方式刚好和外切酶相反，它从多聚核苷 酸链中间开始，在某个位点切断磷酸二酯键。 l在分子生物学研究中最有应用价值的是限制性核酸内 切酶。这种酶可以特异性的水解核酸中某些特定碱基 顺序部位。P150,P161 3核酸的变性、复性、杂交与沉降 l(1) 核酸的变性 l核酸的变性是指核酸双螺旋区的多聚核苷酸链 间的氢键断裂，变成单链结构的过程。变性核 酸将失去其部分或全部的生物活性。核酸的变 性并不涉及磷酸二酯键的断裂，所以它的一级 结构(碱基顺序)保持不变。 l能够引起核酸变性的因素很多。温度升高、酸 碱度改变、甲醛和尿素等的存在均可引起核酸 的变性。 lRNA本身只有局部的双螺旋区，所以变性 行为所引起的性质变化没有DNA那样明显 。 l利用紫外吸收的变化，可以检测核酸变 性的情况。 l例如，天然状态的DNA在完全变性后，紫 外吸收(260 nm)值增加2540%。 l而RNA变性后，约增加1.1%。这种现象称 为增色效应。 DNA变性 l当DNA的稀盐溶 液加热到80- 100时，双螺 旋结构即发生解 体，两条链彼此 分开，形成无规 线团。 lDNA变性后，它 的一系列性质也 随之发生变化， 如紫外吸收(260 nm)值升高, 粘 度降低等。 DNA变性的特征 lDNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内 完成。因此，通常将引起DNA变性的温度称为熔点， 用Tm表示。即紫外吸收(A260吸收)增加值达到总增 加值(最大值)一半时的温度称为DNA的变性温度，即 增色效应达到最大值的1/2（50%）时的温度。 lTm值测定：在0.15mol/L NaCl,0.015mol/L柠檬酸三 钠溶液中进行。 l一般DNA的Tm值在82-95C之间。DNA的Tm值与分子中 的G和C的含量有关。 l变性分成两个阶段：首先富含A-T碱基 对的局部区域分离，随温度升高，到 一个稳定的状态，即富含G-C的区域仍 维持稳定，温度继续升高，双链才彻 底断开，如降温，则分开的单链会快 速重新形成双链。 DNA变性的特征 n 聚合酶链式反应 （PCR） l变性、退火、延伸 三步曲 变性：双链DNA解链 成为单链DNA 退火：部分引物与 模板的单链DNA的特 定互补部位相配对 和结合 延伸：以目的基因 为模板，合成互补 的新DNA链 n 聚合酶链式反应（PCR） l每一轮聚合酶链式反应可 使目的基因片段增加一倍 30轮循环可获得 230（1.07109)个基因片段 lG和C的含量高，Tm值高。因而测定Tm值， 可反映DNA分子中G, C含量，可通过经验 公式计算： l （G+C)%=(Tm-69.3)X2.44 % 69.3： Polyd(A-T) 的Tm 值 2.44:Tm每升高1oC 时增加的(G-C)%含量 l影响Tm 值的因素 (1).DNA样品的均一性（均一性高，熔 解温度范围小） (2).溶液的离子强度(离子强度低，Tm 值较低,磷酸所带的电荷没有被中和，存在静电 排斥，引起DNA在低温下分离。DNA制品应保存 在较高浓度的缓冲液中，在1mol/L NaCl保存) (3).溶液的pH , pH在5-9 ,Tm变化不明 显 (4).变性剂(凡能与核苷酸形成氢键或 干扰碱基堆积作用的小分子物质)，变性剂的存 在降低其Tm值（干扰碱基堆积，增加了吸收） (5).碱基组成，G和C的含量高，Tm值高 (2) 核酸的复性 l变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的单 链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称 为复性。DNA复性后，一系列性质将得到恢复 ，但是生物活性一般只能得到部分的恢复。 l将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能 复性。但是将变性的DNA缓慢冷却时，可以复 性，即退火。 lDNA复性的程度、速率与复性过程的条件有关 。 DNA复性 l复性的速度 l(1).取决于DNA顺序的复杂程度(complexity, C) 顺序简单的DNA分子易复性 具有较多重复序列的DNA，易复性 K = Cot1/2 K：复性反应的动力学常数 Co：变性DNA的初始浓度 t：复性时间，以秒表示 Cot1/2：DNA复性反应的初始浓度与反应完成一半所需 时间的乘积,表示复性反应的速度 K值因复性DNA分子分子量的增加而增大 Cot1/2或K亦称DNA分子复杂度 l(2). DNA溶液的浓度。浓度越大，复性越容易 l(3). DNA片段的大小 小片段比大片段的DNA易复性 (3) 核酸的杂交 l热变性的DNA单链，在复性时并不一定与同源 DNA互补链形成双螺旋结构，它也可以与在某 些区域有互补序列的异源DNA单链形成双螺旋 结构。 l这样形成的新分子称为杂交DNA分子。DNA单链 与互补的RNA链之间也可以发生杂交。 l核酸杂交可以在液相或固相上进行，目前实验 室中应用最广的是硝酸纤维素膜作支持物进行 杂交。如Southern 印迹法。 l核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具 有重要意义。 核 酸 的 杂 交 l*核酸杂交的应用 l 1).用于不同物种的基因组之间或者同一物种的基 因组内类似顺序的检测，进化关系近的物种之间， DNA之间的杂交更广泛。 l 2).用已知顺序的DNA片段为探针(用放射性同位素 标记）在众多的DNA顺序存在时检出一个特殊DNA顺 序或基因。 l3).DNA的体外重组 。 l4).用于检出特殊RNA。 DNA芯片 基因芯片，硝酸纤维膜或尼龙膜作为支 持物，只结合单连DNA 和RNA E.M.Southern Southern Blotting （ Southern 印迹法，DNA印迹法） Southern 印迹法 (1).将DNA用限制酶切割,产生不同长度的DNA片段 。 (2).凝胶电泳分离酶切片段， 经碱（如氢氧化钠 ）处理，使成为单链。 (3).将硝酸纤维膜贴于凝胶板上使分离后的DNA单 链片段吸附于膜上。 (4).加入已标记的探针(顺序已知)进行杂交。 (5).可推知凝胶分离带中的哪一条带含有此基因。 Northern blot (RNA Northern blot (RNA 印迹法印迹法) ) Western blot( Western Western blot( Western 免疫检测实验免疫检测实验) )： 蛋白免疫检测法蛋白免疫检测法 Southern杂交分析示例 A. DNA体外重组实验 B. 抗生素筛选转化子细胞 C. 培养突变株细胞 D. Southern杂交实验结果 显示，外源目的基因已经转 入突变株细胞中 1973年，由美国斯坦福大学教授Cohn和美国加州大学教授 Boyer带领各自的研究组几乎同时分别完成了DNA体外重组， 一举打开了基因工程学大门。 lSouthern Blotting（南印迹）：用于钓基因，即用已 知的DNA单链或RNA，钓取未知DNA分子中的基因，方法 如下： 未知的DNA -DNA限制性内切酶 DNA片段 - 琼脂 糖电泳分离 - 碱液变性 - 影印在硝酸纤维薄膜 上 - 与放射性标记的已知DNA单链或RNA杂交 - 放射自显影 Northern Blotting（北印迹）(RNA (RNA 印迹法印迹法) )：用已知 的DNA钓mRNA，方法如下： 众多未知的RNA - 电泳分离 - 变性 - 影印 - 用标记的已知DNA单链杂交 - 放射自显影 Western Blotting（西印迹）：蛋白质与抗体的杂交， 跟核酸无关。蛋白西印免疫检测法蛋白西印免疫检测法 l Eastern Blotting（东印迹）：利用免疫染色法在薄膜 上探测低分子量化合物 l核酸分子杂交的意义： 1. 发现原核生物的基因是连续基因，而真 核生物的基因是断裂基因。 连续基因：基因中的bp序列能够连续的在成 熟的蛋白质中找到其相应的AA，电镜显示这 种基因能够和它的成熟mRNA形成平滑的杂交 分子。 断裂基因：基因中的bp序列能够断续的在成 熟的蛋白质中找到其相应的AA，电镜显示这 种基因和它的成熟mRNA只能形成带泡的杂交 分子。 l2. 发现癌基因的普遍性：肿瘤病毒的RNA能 够与人类正常的DNA分子形成带泡的杂交分 子。 (4) 核酸的沉降特性 l核酸与蛋白质及其他杂质各有不同的沉降系数，在 超离心机的强大引力场中，它们的沉降速率差异很 大，故可以用超离心法使核酸与其他杂质分开，也 可以将不同中核酸进行分离。密度梯度超离心技术 ，常用蔗糖或氯化铯作为介质,啡啶溴红-氯化铯 密度梯度平衡超离心法。 l超离心沉降后的离心管中，对于拓扑异构体（核苷 酸数目相同的核酸），其沉降速度为： RNA 超螺旋DNA 解链环状DNA 松弛环状DNA 线形DNA 即RNA出现在离心管管底，闭环DNA在第二层，开链 DNA出现在第三层，蛋白质出现在第四层浮力密度 ：(buoyant density，) 在用氯化铯，蔗糖等介质组成的溶液 进行超速离心分离核酸大分子时，离心 管中的介质会自然的形成梯度。当核酸 样品的沉降速度与扩散速度达到平衡时 ，核酸样品形成一稳定的区带，漂浮于 介质梯度中的一定位置上，此时核酸样 品所处位置上的介质密度即为该核酸样 品的浮力密度。 浮力密度与碱基组成、构象、介质 组成等因素有关。 作业 l名词解释 增色效应，核酸变性， 核酸复性，Tm值，杂交。 第四节、核酸的生物功能 和实践意义 l一、DNA的复制与生物遗传信息的保持 lDNA复制的要点是： l1）在复制开始阶段，DNA的双螺旋拆分成两条 单链。 l2）以DNA单链为模板，按照碱基互补配对的原 则, 在DNA聚合酶催化下，合成与模板DNA完全 互补的新链，并形成一个新的DNA分子。 l3) 通过DNA复制形 成的新DNA分子, 与原来的DNA分子 完全相同。 经过 一个复制周期后， 子代DNA分子的两 条链中，一条来自 亲代DNA分子，另 一条是新合成的， 所以又称为半保留 复制。 DNA复制过程 二、RNA与生物遗传信息的表达 l首先，DNA通过 转录作用，将其 所携带的遗传信 息（基因）传递 给 mRNA, 在三 种 RNA（mRNA、 tRNA和rRNA）的 共同作用下，完 成蛋白质的合成 。 中心法则 l生物的遗传信息从 DNA传递给 mRNA的过程称为转录。根据 mRNA链上的遗传信息合成蛋 白质的过程，被称为翻译和 表达。1958年Crick将生物 遗传信息的这种传递方式称为中心法则。 转录过程 翻译过程 1基因的转录 mRNA的合成 l基因转录是以DNA为模板合成与其碱基顺 序互补的mRNA的过程。 l细胞生长周期的某个阶段，DNA双螺旋解 开成为转录模板，在RNA聚合酶催化下， 合成mRNA。mRNA不能自我复制，即其本 身不能作为复制模板，因此在转录过程 中即使出现某些差错，也不会遗传下去 。 lmRNA 是DNA的转录本，携带有合成蛋白 质的全部信息。蛋白质的生物合成实际 上是以mRNA作为模板进行的。 遗传密码 lmRNA分子中所存储的蛋白质合成信息，是由组成它的四 种碱基（A、G、C和U）以特定顺序排列成三个一组的三 联体代表的，即每三个碱基代表一个氨基酸信息。 l这种代表遗传信息的三联体称为密码子，或三联体密码 子。 l因此 mRNA 分子的碱基顺序即表示了所合成蛋白质的氨 基酸顺序。 l mRNA的每一个密码子代表一个氨基酸。20种基本氨基 酸的三联体密码子都已经确定。此外，还有一个密码子 是肽链合成起始密码子, 三个是终止密码子，以保证蛋 白质合成能够有序地进行。 遗传密码 三、蛋白质的生物合成 （1）氨基酸的活化 ltRNA在氨基酰-tRNA 合成酶的帮助下，能够识 别相应的氨基酸，并通过tRNA氨基酸臂的 3- OH 与氨基酸的羧基形成活化酯氨基酰-tRNA 。 l氨基酰-tRNA的形成是一个两步反应过程：第 一步是氨基酸与 ATP 作用, 形成氨基酰腺嘌 呤核苷酸； 第二步是氨基酰基转移到 tRNA 的 3-OH 端上, 形成氨基酰-tRNA。 （1）氨基酸的活化 氨基酸活化的总反应式是： 氨基酰-tRNA 合成酶 l氨基酸 + ATP + tRNA + H2O 氨基酰-tRNA + AMP + PPi l每一种氨基酸至少有一种对应的氨基酰-tRNA 合成酶 。它既催化氨基酸与 ATP 的作用, 也催化氨基酰基转 移到 tRNA。 l氨基酰-tRNA 合成酶具有高度的专一性。 每一种氨基 酰-tRNA 合成酶只能识别一种相应的 tRNA。 ltRNA 分子能接受相应的氨基酸, 决定于它特有的碱基 顺序, 而这种碱基顺序能够被氨基酰-tRNA 合成酶所识 别。 (2)氨基酰-tRNA在mRNA模板指导下组 装成蛋白质 l氨基酰-tRNA通过反密码环上的三联体反密码 子识别mRNA上相应的遗传密码，并将所携带的 氨基酸按mRNA遗传密码的顺序安置在特定的位 置，最后在核糖体中合成肽链。 l现在已经知道作为多肽合成起始信号的密码子 有两个，即甲硫氨酸的密码子(AUG)和缬氨酸 的密码子(GUG)(极少出现)。在大肠杆菌中, 起始密码子AUG 所编码的氨基酸并不是甲硫氨 酸本身, 而是甲酰甲硫氨酸。 四、遗传变异的化学本质 lDNA结构的改变将导致相应蛋白质一级结 构（氨基酸顺序）的变化，从而引起生 物特征或性状发生变异。 l所以，一切生物的变异和进化都可以认 为是由于DNA结构的改变而引起蛋白质组 成和性质变化的结果。 1，DNA结构变化的类型及影响因素 l生物遗传变异的分 子机制是DNA分子 中为氨基酸编码的 三联体密码子的改 变。DNA遗传密码 的改变主要有如下 几种类型： 碱 基顺序颠倒，如TA 被颠倒成AT； l 某个碱基被 调换，如AT换成 GC； l 少了或多了一对或几对碱基，例如： l5 ATGGCTATGC 3 变成 5 ATGGTATGC 3 3 TACCGATACG 5 3 TACCATACG 5 基因突变 血红蛋白链基因突变 基因突变 l上述DNA碱基顺序的改变，是DNA在复制 过程中出现错误产生的。由于DNA是具有 复制功能的分子，一旦DNA碱基顺序出错 ，它就会通过复制机制遗传下去。 l由于DNA碱基顺序的改变引起生物遗传性 状显著变化的现象，称为基因“突变” 。 l基因“突变”有以下原因: (1) DNA分子中碱基互变异构 lDNA分子的碱基，存在酮式烯醇式或氨 式亚胺式互变异构。不同的互变异构 体形成氢键的方向和能力不同，有可能 导致复制时出现错误。 l例如在正常情况下，A（氨式结构）与T （酮式结构）配对；当A以亚胺式存在时 （几率非常小），则与C配对。 (2) 物理因素 l能够引起基因突变的物理因素主要包括 ：紫外线（UV）、高能射线和电离辐射 等。 l当DNA受到大剂量紫外线（波长260nm附近 ）照射时，可引起DNA链上相邻的两个嘧啶 碱基共价聚合，形成二聚体，例如TT二聚 体。 光聚合反应 l胸腺嘧啶碱基在紫外光照射下，可以发生二聚加成反 应： l l在DNA分子中，如果两个胸腺嘧啶碱基相邻，在紫外光 照射下，可能发生上述聚合反应，其结果是破坏了正 常复制或转录。 lX-射线以及放射性物质产生的辐射具有 很高的能量，能直接引起DNA物理或化学 性质的改变。另外，电离辐射将也能使 DNA周围环绕的其它分子（主要是水）产 生具有很高活性的自由基，这些自由基 能够进一步与DNA分子反应，导致DNA结 构发生变化。 (3) 化学因素 l化学因素是引起DNA结构发生变化的最常 见因素，主要包括：烷基化试剂，亚硝 酸盐以及碱基类似物等。 l烷基化试剂能够与DNA分子中的氨基或氧 作用，生成烷基化DNA。除了碱基上有多 个位置可被烷基化外，DNA链上磷酸二酯 键中的氧也容易被烷基化，从而导致DNA 链的断裂。 烷基化反应 l由于含氧碱基存在酮式和烯醇式的互变 异构，烯醇式中的羟基可以被烷基化转 变为稳定的烯醇醚。 l鸟嘌呤核苷烷基化形成6-甲氧基鸟嘌呤 核苷后，不再与C配对，而与T配对。 l这种情况将引起DNA的复制、转录及信息 表达出现错误。 l亚硝酸盐在日常生活中大量存在，比方说黄了 的青菜叶子、腊肉、酸菜等腌制品中都有存在 。通常它在人体内不会产生蓄积，但是一次性 摄入过量就会中毒。 l 针对主要的中毒原因可采取如下预防措施： 蔬菜应妥善保存，防止腐烂，不吃腐烂的蔬 菜；食剩的熟菜不可在高温下存放长时间后 再食用；勿食大量刚腌的菜，腌菜时盐应多 放，至少腌至15天以上再食用；但现泡的菜， 最好马上就吃，不能存放过久，腌菜时选用新 鲜菜；不要在短时间内吃大量叶菜类蔬菜， 或先用开水烫5分钟，弃汤后再烹调；肉制 品中硝酸盐和亚硝酸盐用量要严格按国家卫生 标准规定，不可多加；苦井水勿用于煮粥，尤 其勿存放过夜；防止错把亚硝酸盐当食盐或 碱面用。 亚硝酸引起的反应 亚硝酸引起的反应 l环外氨基在适当条件下，也可以发生化学反应。 l胞嘧啶核苷在亚硝酸作用下，可以形成重氮盐，再转 变为尿嘧啶核苷。因此生物体内亚硝酸的存在有可能 改变DNA的碱基组成。 l腺嘌呤核苷和鸟嘌呤核苷也能发生类似的反应，分别 形成次黄嘌呤核苷（I）和黄嘌呤核苷（X）。 l这种变化，将影响或改变碱基形成氢键的能力和方向 ，导致DNA复制错误，是引起基因突变的重要原因之一 。 l碱基类似物是一类结构与核酸碱基相似的人工 合成或天然化合物，由于它们的结构与核酸的 碱基相似，当这些物质进入细胞后能够掺入到 DNA链中，干扰DNA的正常复制和转录。 l常见的有碱基衍生物及稠环、稠杂环类化合物 。例如5-溴尿嘧啶（5-BU），它与胸腺嘧啶碱 基的结构相似，能取代T与A配对。 l又如一种称为二恶英的含氯芳香杂三环化合物 （2,3,7,8-四氯-二苯-二恶英，简称TCDD）， 是一种具有强烈致癌和致畸物质。它能够进入 细胞并与DNA结合，导致DNA复制发生错误，从 而可能诱发癌变。 碱基类似物 何谓二恶英？ l二恶英（英文dioxins）是一类多氯代三环芳 香化合物，根据其分子中氯原子的不同取代位 置和数目，能产生209种异构体。这些化合物 大部分具有强烈致癌、致畸、致突变的特点， 其中又以2 ，3，7，8位氯取代的那些异构体 毒性最大。例如，2，3，7，8-四氯-二苯-二 恶英是目前世界上已知的一级致癌物中毒性最 强的有毒化合物。国际组织已将其列为人类一 级致癌物。1988年，美国发表了全球第一个二 恶英危险评价报告，指出一万个癌症病人中， 就有一个是因二恶英引起的； 1995年该报告 的第二版已将这个数值修订为千分之一。它不 仅具有致癌性，而且具有生殖毒性、免疫毒性 、和内分泌毒性。二恶英由于其来源广泛、毒 性强，已被世界各国公认为是对人类健康具有 极大潜在危害的全球性散布的重要有机污染物 。 这种可怕的“世纪之毒”是从哪里来的？ l自然界中森林火灾能够产生二恶英，但更主要 来自人类活动。发达国家城市生活垃圾焚烧炉 燃烧过程中所产生的二恶英占已知二恶英各生 成源生成量的95；在生产杀虫剂、防腐剂、 除草剂和油漆添加剂等化工过程中，二恶英往 往作为副产品和杂质的形式存在其中；还有纸 浆漂白，汽车尾气和金属的熔炼等都是产生二 恶英的主要来源。为此，国际上认为二恶英是 人类社会进入工业化之后的典型副产物。 人类受到二恶英危害的主要途径 l由于二恶英化学结构稳定，亲脂性高， 又不能生物降解，因而具有很高环境滞 留性。无论存在于空气、水还是土壤中 ，它都能强烈地吸附于颗粒上，借助于 水生和陆生食物链不断富集而最终危害 人类。尤其是吸入空气中带有二恶英的 细粒子和摄入被二恶英污染的各种食物 ，是人类受到二恶英危害的主要途径。 纤维食品有助排除二恶英 l纤维食物和叶绿素有助于消除体内累积 的二恶英，最有效的食物依次是米糠、 菠菜和萝卜的叶子。 纤维食物和叶绿素在人体内有吸纳二恶 英和大便一起排出体外的解毒作用。因 此，多吃凉拌的绿色蔬菜以消除体内长 期累积的二恶英剧毒。 l随着食物而进入体内的二恶英首先被小肠吸收 ，经过血液散布到体内各部位，并将会随着血 液再被运送到其他的内脏和组织中。例如在肝 脏的二恶英，会随着胆汁而排到十二指肠，被 小肠吸收后再次进入体内各部位，形成所谓“ 肠肝循环”，使二恶英始终难以排出体外。 以食物纤维解毒，正是反利用“肠肝循环”这种 特点，在二恶英由肝脏排出而被小肠吸收之前 ，以食用的纤维食物和叶绿素使二恶英附着在 上面，然后随着大便排出体外。 纤维食品有助排除二恶英 l本次教学任务结束， 下课！ 基因工程 定义 将不同生物的外源DNA(基因）插入到 载体分子上，形成“杂种”DNA分子， 导入受体细胞中扩增和表达 。 生物技术的四大体系生物技术的四大体系 基因工程的内容基因工程的内容 目的基因的获得目的基因的获得 目的基因与载体的连接成重组目的基因与载体的连接成重组 DNADNA分子分子 重组重组DNADNA分子导入受体细胞分子导