微生物的实验室培养(2014上课).ppt

到目前为止， 几十项Nobel生理学和医学奖，化学奖 都与微生物学有关 微生物的类群 原生生物： 原核生物 : 真菌: 病毒: 如酵母菌 单细胞的动植物 如草履虫、单细胞藻类等 无细胞结构 真核细胞 细菌、蓝藻原核细胞 课题1 微生物的实验室培养 1.提供营养和条件 2.防止污染 一.培养基：微生物生存的环境和营养物质 1.基本成分： 思考：微生物“吃”什么？ 碳源、氮源、水、无机盐 碳源 无机碳源： 有机碳源： CO2、CO32-、HCO3- 牛肉膏、蛋白胨等 自养微生物 异养微生物 氮源 无机氮源： 有机氮源： NH4、NO3-（为硝化细菌提供N源和能源） 牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等 注：含CHON的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源 一.培养基：微生物生存的环境和营养物质 1.基本成分：碳源、氮源、水、无机盐 2.特殊营养：维生素、碱基等（生长因子 ） （牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有） 3.pH、氧气的需求： 4.种类： 固体培养基 液体培养基 有无 凝固剂琼脂 分离 鉴定 工业 生产 化学成分： 物理性质： 天然培养基 合成培养基 牛肉膏蛋白胨培养基 是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。 1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方 H2O 定容至1000ml Nacl 5g 蛋白胨 10g 牛肉膏 5g 琼脂20.0g 分析营养构成？ 5. 配制原则 目的明确： 营养全面、浓度适宜、比例恰当 适宜的pH值： 有机碳源异养型： 根据微生物的种类、培养目的选择原料 自养型： 不加碳源 加入缓冲剂 细菌偏碱，真菌偏酸 （CO2碳源） 生产科研 耐高温需保持干燥的 物品，160170 12小时 接种环、接种针等 金属用具7075、30min 80、15min 100、56min 消毒灭菌 定义 方法 较为温和理化方法， 杀死部分有害菌体 （不包括芽孢、孢子） 强烈的理化方法， 杀死所有微生物 （包括芽孢、孢子） 煮沸消毒法 巴氏消毒法 化学药剂 紫外线 灼烧灭菌 干热灭菌 酒精、氯气、石炭酸等 高压蒸汽灭菌 培养基， 100KPa、 121、1530min 二.无菌技术：防止外来杂菌的污染 1.消毒与灭菌： 请你判断以下材料或用具是否需要消毒或 灭菌。如果需要，请选择合适的方法。 （1） 培养细菌用的培养基与培养皿 （2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管 （3） 实验操作者的双手 2.无菌范围：实验操作空间消毒 操作者的手、衣着消毒 实验用具灭菌 实验操作过程 二.无菌技术：防止外来杂菌的污染 1.消毒与灭菌： 酒精灯旁操作 超净工作台 有些细菌在一定的条件下，细胞里面 形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢 。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高 温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例 如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后 才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘 散。当环境适宜（如温度、水分适宜 ）的时候，芽孢又可以萌发，形成一 个细菌 细菌、原生动物、真菌和植物 等产生的一种有繁殖作用的生 殖细胞。能直接发育成新个体 。 单个 或少数菌体 2.特征 ： 大小、形状、光泽度、 颜色、透明度等。 3.功能： 1.定义： 菌落 鉴定菌种的重要依据 固体培养基上 大量繁殖 子细胞群体 1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方 H2O 定容至1000ml Nacl 5g 蛋白胨 10g 牛肉膏 5g 琼脂20.0g 三.大肠杆菌的纯化培养： 制备牛肉膏蛋白胨固体培养基 1.计算：培养基用量 依配方计算各成分的用量 2.称量： 3.溶化： 牛肉膏黏稠，用称量纸称取 牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖 牛肉膏、称量纸 、少量水加热溶解 取纸 蛋白胨、NaCl琼脂 补水定容 4.调pH、分装、封口： 5.灭菌： 6.倒平板： 培养基、培养皿 分散成单个细胞,形成单个菌落 倒平板倒平板 约50 防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染 灼烧灭菌， 防止瓶口的微生物污染培养基 1.培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时 ，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基 的温度？ 答：可以用手触摸盛有培养基的锥形 瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手 时，就可以进行倒平板了。 2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？ 答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微 生物污染培养基。 3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？ 4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅 在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来 培养微生物吗？为什么？ 答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固 后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置， 既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以 防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。 答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之 间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板 培养微生物。 二.大肠杆菌的纯化培养： 制备牛肉膏蛋白胨固体培养基 纯化大肠杆菌： 平板划线法： 菌种 划3个平板 1个不划线 1.纯化大肠杆菌的方法：平板划线法和稀释涂布平板法 接种环 防止划破培养基 （重复实验） （空白对照） 平板划线法平板划线法 平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表 面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到 培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由 一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。 1、为什么在操作的第一步以及每次划线之前 都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需 要灼烧接种环吗？为什么？ 操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上 可能存在的微生物污染培养物 杀死上次残留的菌种，保证使下一次划线时， 菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划 线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐 减少，以便得到菌落。 及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染 环境和感染操作者。 2.在灼烧接种环之后，为什么要等其 冷却后再进行划线？ 答：以免接种环温度太高，杀死菌种。 3.在作第二次以及其后的划线操作时， 为什么总是从上一次划线的末端开始划线？ 答：划线后，线条末端细菌的数目比线 条起始处要少，每次从上一次划线的末端开 始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而 逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来 的菌落。 6支试管，分别加入9ml无菌水 1ml 101 1ml 102 1ml 103 1ml 104 1ml 105 1ml 106 稀释涂布平板法： a.梯度稀释菌液： 菌液 微量 移 液器 浸 稀释涂布平板法： a.梯度稀释菌液： b.涂布平板： 不超过0.1ml 各梯度分别涂布3个平板 1个不涂布作空白对照 滴 灼 涂 稀 释 103 倍 稀 释 104 倍 稀 释 105 倍 稀释涂布法稀释涂布法 稀释涂布法是将菌液进行一系列梯度稀释， 然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培 养基的表面，进行培养。 涂布平板的所有操作都应在火焰附近 进行。结合平板划线与系列稀释的无菌 操作要求，想一想，第2步应如何进行无 菌操作？ 应从操作的各个细节保证“无菌”。 例如：酒精灯与培养皿的距离要合适、 吸管头不要接触任何其他物体、 吸管要在酒精灯火焰周围等等。 3平板划线线法和稀释释涂布平板法的比 较较 优优点缺点适用范围围 平板划线线 分离法 可以观观察菌落特 征，对对混合菌进进 行分离 不能计计数适用于好氧菌 稀释释涂布 平板法 可以计计数，可以 观观察菌落特征 吸收量较较少、 较较麻烦烦，平板 不干燥效果不 好，容易蔓延 适用于厌厌氧菌 和兼性厌厌氧菌 平板划线法： 二.大肠杆菌的纯化培养： 制备牛肉膏蛋白胨固体培养基 纯化大肠杆菌： 1.接种： 稀释涂布平板法： 2.培养：将接种后的培养基和一个未接种的培养基 放入37恒温箱中培养12h24h后， 观察并记录 稀 释 103 倍 稀 释 104 倍 稀 释 105 倍 （三）菌种的保藏： 1.临时保藏： 试管固体斜面培养基上 ，培养长成菌落 4冰箱保存 2.长期保存： 菌种易被污染、变异 甘油管藏 1ml甘油（灭菌）1ml菌液 20 搁置斜 面 四、课题成果评价 （一）培养基的制作是否合格 如果未接种的培养基在恒温箱中保温12 d后无 菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新 制备。 （二）接种操作是否符合无菌要求 如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基 本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作 是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明 接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因， 再次练习。 （三）是否进行了及时细致的观察与记录 培养12 h与24 h后的大肠杆菌菌落的大小会有明 显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察 到其他一些细微的变