《CR扩增基因》PPT课件.ppt

PCRPCR扩增目的基因扩增目的基因 制作人：江乐明制作人：江乐明 【PCRPCR 原理原理】 n n 聚合酶链式反应聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)(Polymerase Chain Reaction, PCR)是是 一种一种选择性体外扩增选择性体外扩增DNADNA的方法的方法，其基本原理类，其基本原理类 似于似于DNADNA的天然复制过程。的天然复制过程。 n n 反应包括反应包括: : 变性变性(Denature) (Denature) 、 退火退火(Anneal)(Anneal)和延伸和延伸 (Extension)(Extension)三个基本步骤。三个基本步骤。 n n 这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循 环将使目的环将使目的DNADNA扩增一倍，这些经合成产生的扩增一倍，这些经合成产生的 DNADNA又可作为下一轮循环的模板，所以经又可作为下一轮循环的模板，所以经25253535 轮循环就可使轮循环就可使DNADNA扩增达扩增达1010 6 6 倍。倍。 加热加热 变变 性性 复复 性性 复 温 DNADNA的变性和复性的变性和复性 加热或强酸、碱性作用加热或强酸、碱性作用 可以使可以使 DNADNA双螺旋的氢键断双螺旋的氢键断 裂裂, ,双链解离双链解离, ,形成单链形成单链DNA,DNA, 这称为这称为 DNADNA的变性的变性。 解除变性的条件后解除变性的条件后, , 变变 性的单链可以重新结合起来性的单链可以重新结合起来 , ,形成双链形成双链, ,其原有的特性和其原有的特性和 活性可以恢复活性可以恢复, ,这称这称DNADNA复性复性 , , 也叫退火也叫退火。 PCRPCR扩增原理扩增原理 延伸延伸 变性、退火变性、退火 5 5 3 3 5 5 3 3 3 3 5 5 变性变性 退火退火 3 3 5 5 延伸延伸 n n 变性变性：加热，使模板：加热，使模板DNADNA在高温下（在高温下（9494）变性）变性 ，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶 段。段。 n n 退火退火：溶液温度降至：溶液温度降至45456565，模板，模板DNADNA与引物与引物 按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。 n n 延伸延伸：溶液反应温度升至：溶液反应温度升至7272，耐热，耐热DNADNA聚合酶聚合酶 以单链为模板，利用引物的以单链为模板，利用引物的3 3 -OH-OH，以反应混合物，以反应混合物 中的中的4 4种脱氧核苷三磷酸（种脱氧核苷三磷酸（dNTPdNTP）为底物，按）为底物，按5 5 3 3 方向复制出互补方向复制出互补DNADNA，即引物的延伸阶段。，即引物的延伸阶段。 PCR的三个热反应过程 温度（温度（ ） 时间（时间（minmin ） 9494 7272 6060 9494变性（变性（ 1min1min） 60 60 退火退火 （1min1min） 72 72 延伸延伸 （1.5min1.5min） 循环循环1 1 循环循环2 2 循环循环3 3 PCRPCR反应的温度循环周期反应的温度循环周期 PCR PCR 反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由DNADNA变性、变性、 引物退火和反应延伸三个步骤完成的。如此周而复引物退火和反应延伸三个步骤完成的。如此周而复 始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求 为止。为止。 PCR的产量 u 每一次循环后模板比前一次循环增加一倍 。 u DNA产量以指数上升，n个循环后，达到2n 拷贝。 【仪器耗材与试剂仪器耗材与试剂】 （一）仪器与耗材（一）仪器与耗材 1. PCR1. PCR热循环仪热循环仪 2. 202. 20LL、 200L 200L 吸头，吸头，200200LL、500L 500L EPEP管，管， 1010LL、 50L50L、200L200L移液器移液器 3. PCR 3. PCR 电泳仪和电泳槽电泳仪和电泳槽 （二）试剂（二）试剂 1. 1. 10PCR Buffer10PCR Buffer； 2. 2. MgClMgCl2, 2, 25 mmol/L 25 mmol/L； 3. 3. dNTPdNTP（ 其中包括其中包括dATPdATP、dCTPdCTP、dGTPdGTP与与dTTPdTTP；每种；每种 浓度均为浓度均为10 mmol/L 10 mmol/L ）；）； 4. 4. 正向引物与反向引物（正向引物与反向引物（10 M/L10 M/L）；）； 5. 5. Taq DNATaq DNA聚合酶（聚合酶（1U/L1U/L）；）； 6. 6. DNADNA模板模板 （小鼠基因组（小鼠基因组DNADNA，100ng/L 100ng/L ， 反转录反转录 cDNAcDNA）；）； 7. 7. ddHddH 2 2 O O 【实验步骤实验步骤】 n n 1. 1. 在在0.2 mL Eppendorff 0.2 mL Eppendorff 管内配置管内配置20 L20 L反应体系反应体系 ： 反应物反应物 体积（体积（LL） dd Hdd H 2 2 O O 1212 PCRPCR缓冲液缓冲液 （1010） 2 2 MgClMgCl 2 2 （25 mmol/L25 mmol/L） 2 2 dNTP dNTP （10 mmol/L 10 mmol/L ）1.01.0 正向引物正向引物 （ 10 M/L 10 M/L ）0.50.5 反向引物反向引物 （ 10 M/L 10 M/L ）0.50.5 Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 1 1 模板模板DNA DNA 1 1 2. 2. 按下述程序进行按下述程序进行PCRPCR扩增扩增: : 1 1） 9494 预变性预变性 3 min3 min； 2 2） 9494 变性变性 1 min1 min； 3 3） 5555 退火退火 30 sec30 sec； 4 4） 7272 延伸延伸 30 sec30 sec； 5 5） 重复步骤重复步骤24, 3424, 34次；次； 6 6） 7272 延伸延伸 5 min5 min； 7 7） 4 4 , 3min., 3min. 3. 3. 琼脂糖凝胶电泳分析琼脂糖凝胶电泳分析PCRPCR结果结果 n n 配制配制2 2琼脂糖凝胶，取琼脂糖凝胶，取10 L10 L扩增产物扩增产物 电泳。保持电压电泳。保持电压100V100V。电泳结束后，在。电泳结束后，在 紫外灯下观察结果。紫外灯下观察结果。 4. PCR的反应体系中各组分作用 DNA 模板 (template) 引物 (primer) 4种脱氧核苷酸 （dNTP） DNA聚合酶 （Taq） 反应缓冲液 Mg2+及某些使酶稳定的辅剂 质量：要求有较高纯度的DNA样品 避免反复冻融，防止降解 数量: 25-100ng/20l 1）DNA 模板 2）引物 与模板DNA的某个局域具有互补碱基特异性 的短的单链DNA片段。 3）dNTP 4种 dNTP 用量应均衡，否则会减少 Taq 酶合 成的忠实性，增加错配率。 l最初的聚合酶 大肠杆菌DNA 聚合酶 klenow 片段, 不耐热，每次加热变性后需重新补加。 聚合温度偏低（37 ），产生非特异性扩增 lTaq DNA 聚合酶 从水生栖热菌中分离，可在70-75生长。 Taq 酶扩增效率: 600bp/min 错配率: 1bp/4000bp (无3-5外切酶活性) 4）DNA聚合酶 作用: 增强酶蛋白的稳定性，维持酶活性。 增加 dsDNA 的 Tm 值，提高融合温度。 与游离 dNTP 形成可溶性复合物，有利 dNTP 渗入 。 浓度: 1.5-2.0 mmol/l 5）缓冲液中的Mg2+ 6）循环次数 循环次数是2535次。 循环次数过多，产生平台效应；非特异性扩增产物增 加。 5. PCR5. PCR反应常见问题反应常见问题 1. 1. 没有任何产物：没有任何产物： 模板太少，模板含有大量杂质（蛋白，酶抑制剂）模板太少，模板含有大量杂质（蛋白，酶抑制剂） 酶失活或者忘记添加酶失活或者忘记添加 引物设计，浓度引物设计，浓度 MgMg2+ 2+浓度太低 浓度太低 变性时间太短，退火温度过高，延伸时间太短等变性时间太短，退火温度过高，延伸时间太短等 2. 2. 产生多个条带：产生多个条带： 引物与非目的片段存在互补，或者浓度太高引物与非目的片段存在互补，或者浓度太高