《CR及相关技术》PPT课件.ppt

一、聚合酶链式反应（PCR） l聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）：是一种体外酶促扩增特定DNA片段的技 术，即将微量的DNA进行成倍扩增。 DateDate 1 1 （一）原理： 建立在DNA复制原理基础上的一种技术。 DateDate 2 2 DateDate 3 3 （二）典型的PCR包括许多循环，每个循环包括三个步骤： （1）高温变性模板使之成为单链，95度约1min； （2）低温使引物与单链模板退火（复性）55度左右； （3）中温使引物沿模板延伸，75度左右。 经n次（25-30次）循环后，反应混合物中所含目的DNA片段 （双链）的拷贝数理论上最高值为2n。但是，在第三轮循 环后，才会出现目的DNA片段。 DateDate 4 4 DateDate 5 5 思 考 题 l扩增片断的长度的是如何决定的？ l若以N 表示扩增循环数，当一条双链模板 循环扩增30次时，反应体系中总分子数多 少？非目的产物多少？目的产物多少？ l若用一条引物能否实现大量扩增？ DateDate 6 6 （三）PCR反应体系： 反应缓冲液（10PCR Buffer） 脱氧核苷三磷酸底物（dNTPmix） 耐热DNA聚合酶（Taq酶，可耐受95度左右高温） 寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2，约20个核苷酸 ，与目的DNA两侧的区域互补） 靶序列（DNA模板）五部分组成。 DateDate 7 7 DateDate 8 8 1. 耐热DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶的特点 Taq DNA聚合酶是从一种极度嗜热水生栖热菌YT-1中分离纯化而得。 1) 具有5-3聚合酶活性和5 3核酸外切酶活性 2) 最适反应温度为80 3) 最适pH8.0和最佳反缓冲液 TrisHCl 4) 最佳二价阳离子Mg2+ ，其浓度取决于dNTP浓度（2 mM） 5) 具良好的热稳定性：在90下连续反应30分钟仍有约50%的酶活 核苷酸错误掺入的几率比较高 DateDate 9 9 Taq DNA聚合酶的特性 DateDate1010 Tth DNA 聚合酶的特点： 从喜温性真菌中分离获得 1) 具有强的5-3聚合酶活性，缺3-5核酸外切酶活性。 2) 反应pH值为9，最适温度为75度。 3) 在Mn2+存在时，具有很强的反转录酶活性。 4) 当系统同时存在Mg2+时，反转录产生的cDNA在这种酶的作用下还可 以进行PCR扩增。 故可用于RT-PCR。 DateDate1111 Pwo DNA聚合酶 从喜温性古细菌中发现，现在市场销售的Pwo DNA聚合酶是在E.coli中 表达后提取的产物。 1) 具有强的5-3聚合酶活性，兼有3-5外切酶活性。 2) 具有高的耐热性，100度下2小时后仍有一半的活性。 3) 可扩增5kb的片段，扩增DNA的准确度比Taq DNA聚合酶高约10倍 。 4) 且其扩增产物为平末端，可直接用于平末端连接。 C.therm.聚合酶 1) 是一种以Mg2+为辅助因子的逆转录酶，最适温度在60-70度之间。在 RT-PCR系统中催化逆转录反应。 2) 具有3-5外切酶活性，合成cDNA准确度比Tth DNA聚合酶高约2倍 。 DateDate1212 2.模板： lPCR扩增的模板通常是从细胞中提取出来的总DNA，也 可以是mRNA反转录后形成的cDNA。 lDNA是一种非常稳定的分子，其作为模板影响PCR效果 的因素有： 1. 模板的纯度； 2. 模板DNA的量； DateDate1313 3. PCR引物： PCR引物是与模板DNA互补的两条人工合成的寡核苷酸 链，通常由15-30个核苷酸构成。引物与单链DNA模板的 3端互补且具有游离的3羟基。引物互补于所需扩增DNA 片段的两端，使DNA片段的扩增只限于引物之间的区段 。 35 53 -OH HO- DateDate1414 引物的设计： 1. 引物长度：一般20bp左右。 2. 引物的碱基组成：一般G+C占50-60%，尽量避免数个连续排列的嘌 呤或嘧啶。一对引物之间不能有2个以上的碱基互补，特别是3端； 引物本身避免有回文序列。 3. 酶切位点的设计：PCR扩增中，对引物5端碱基的要求较低，可在 引物的5端加上特殊序列，如限制性酶切位点。 4. 复性的温度：引物与模板复性温度和所需时间取决于引物的碱基组 成、长度、溶液中引物的浓度。复性温度一般低于引物本身的实际 变性温度（Tm）5度。Tm=（G+C）X4（A+T）X2。复性温度通 常在55-72度之间，提高复性温度可提高引物与模板结合的特异性。 DateDate1515 4. dNTPs： 是dATP、dCTP、dGTP、dTTP的总称，储存液pH7.0，浓度一般 为2mM，分装后20度冻存。典型的PCR扩增体系中，dNTPs的终 浓度为20-200uM。 5. Mg2+浓度： Mg2+浓度太低会无PCR产物，太高会导致非特异产物的合成。通常 情况下，反应体系中有0.5-2.5mM游离Mg2+。 6. PCR系统中的其他成分： PCR反应缓冲液通常用10mMTris-HCl(pH8.3)；50mMKCl；明胶或 血清白蛋白（100ug/ml）及非离子去污剂等。 DateDate1616 PCR仪 DateDate1717 （四）PCR反应技术类型 1. 巢式PCR（nested PCR）： 设计两对引物，先用第一对引物扩增，然后以此扩增产 物为模板，再用第二对引物继续扩增。可增加扩增的灵 敏度，比单一的一对引物PCR扩增灵敏度特异性增加 1000倍。 DateDate1818 DateDate1919 2. 不对称PCR（asymmetric PCR）： 多用于序列分析。扩增时两引物按50:1比例加入反应体系 。最终扩增产物大部分是单链DNA，可用于对靶序列进 行测序。 DateDate2020 DateDate2121 3. 反转录PCR： 是一种从RNA扩增 cDNA拷贝的方法。 DateDate2222 4. 定量PCR（quantitative PCR，Q-PCR）： 是应用一种标准作对照，估计出一种特异性靶DNA或 RNA分子相对含量的技术。 DateDate2323 介绍：基于PCR的分子标记技术 DateDate2424 遗传标记 l遗传标记（Genetic marker）指可识别的等位基因 。它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性， 因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为 遗传标记。 l类型： 形态标记（morphological marker） 细胞学标记(cytological marker) 生化标记(biochemical marker) 分子标记(molecular marker) DateDate2525 在遗传育种研究中可被利用的遗传标记应具备 以下几个条件： （1）多态性高； （2）表现共显性； （3）对农艺性状影响小； （4）经济方便，容易观察记载。 DateDate2626 一、形态标记 即外部形态特征。主要包括肉眼可见的外 部特征，如：矮秆、紫鞘、卷叶等；也包括色 素、生理特性、生殖特性、抗病虫性等有关的 一些特性。 形态标记简单直观、经济方便；但数量在 多数生物中有限，且多态性较差，表现易受环 境影响，并且有一些标记与不良性状连锁。此 外形态标记的获得需要通过诱变、分离纯合的 过程，周期较长。因此形态标记在遗传育种中 的作用是有限的。 DateDate2727 二、细胞学标记 即细胞染色体的变异：包括染色体核型 （染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置 等）和带型（C带、N带、G带等）的变化。 与形态标记相比，细胞学标记的优点是能 进行一些重要基因的染色体或染色体区域定位 。但细胞学标记材料需要花费较大的人力和较 长时间来培育，难度很大；同时某些物种对染 色体变异反应敏感；还有些变异难以用细胞学 方法进行检测。因此到目前为止，真正应用于 遗传育种研究中的细胞学标记还很少。 DateDate2828 三、生化标记 主要包括同工酶和等位酶标记。 同工酶：指结构不同、功能相似的酶，也即具有 同一底物专一性的不同分子形式的酶。属于一 个以上基因座位编码的酶的不同形式； 等位酶：是指由一个基因座的不同等位基因编码 的酶的不同分子形式； 分析方法：从组织的蛋白粗提物中通过电泳和组 织化学染色法将酶的多种形式转变成肉眼可辩 的酶谱带型。 DateDate2929 l与形态标记、细胞学标记相比，生化标 记具两个方面的优点： 一是表现近中性，对植物经济性状一般没 有大的不良影响； 二是直接反映了基因产物差异，受环境影 响较小。但目前可使用的生化标记数量 还相当有限，且有些酶的染色方法和电 泳技术有一定难度，因此其实际应用受 到一定限制。 DateDate3030 四、分子标记（DNA标记） 在遗传学研究中广泛应用的DNA分子标记已 经发展了很多种，一般依其所用的分子生物学 技术大致可以分为两大类： DateDate3131 （1）以Southern杂交技术为核心的分子标记，（如RFLP ），这类分子标记被称为第一代分子标记。 （2）是以PCR技术为核心的分子标记，（如STS、RAPD 、AFLP、SSR）等，这类分子标记被称为第二代分子标 记； （3）单核苷酸多态性（SNP）标记被称为第三代分子标记 。它也是以PCR技术为基础的分子标记技术。 DateDate3232 英文缩英文缩 写写 英文名称英文名称中文名称中文名称 RFLPRFLPRestriction fragment length Restriction fragment length polymorphismpolymorphism 限制性片段长度多态限制性片段长度多态 性性 STSSTSSequence tagged siteSequence tagged site序列标签位点序列标签位点 RAPDRAPDRandom amplified Random amplified polymorpolymor- - PhicPhic DNA DNA 随机扩增多态性随机扩增多态性DNADNA AFLPAFLPAmplified fragment lengthAmplified fragment length PolymorphismPolymorphism 扩增片断长度多态性扩增片断长度多态性 SSRSSRSimple sequence repeatSimple sequence repeat简单序列重复简单序列重复 SNPSNPSingle Single nucleotide nucleotide polymorpolymor- - phismphism 单核苷酸多态性单核苷酸多态性 几种主要的分子标记几种主要的分子标记 DateDate3333 几种主要的分子标记 （一）RFLP标记：称为限制性片段长度多 态性，是指用某一种限制性内切酶来切割 来自不同个体的DNA分子上，内切酶的识 别序列有差异，即是由限制性酶切位点上 碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起 的。这种差异反映在酶切片段的长度和数 目上。 DateDate3434 RFLP标记是发展最早的DNA标记技术。 RFLP技术主要包括以下基本步骤： DNA提取 用限制性内切酶酶切DNA 、 用凝胶电泳分开DNA片段 把DNA片段 转移到滤膜上 利用放射性标记的探针杂交 显示特定的DNA片段（Southern杂交）和结 果分析。 DateDate3535 DateDate3636 DateDate3737 特点 A 无表型效应，RFLP标记的检测不受环境 条件和发育阶段的影响。 B RFLP标记在等位基因之间是共显性的， 因此在配制杂交组合时不受杂交方式的影响 。 C 在非等位的RFLP标记之间不存在上位效 应，因而互不干扰 DateDate3838 D RFLP标记起源于基因组DNA的自身变异 ，在数量上几乎不受限制 E DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用 于大规模的育种实践中。在植物分子标记 辅助育种中需要将RFLP转换成以PCR为 基础的标记。 DateDate3939 （二）AFLP标记 AFLP标记是扩增片段长度多态性的简称 是RFLP与PCR两项技术相结合的产物， AFLP技术的主要步骤： DNA提取 两种限制性内切酶酶切DNA 寡聚核苷酸接头的连接 对限制性酶切片 段的选择性扩增 扩增产物的电泳分析。 由于不同材料DNA酶切片段存在差异，因而便 产生发扩增产物的多态性。 DateDate4040 lAFLP标记的主要特点有： （1）由于AFLP分析可以采用的限制性内切酶及选 择性碱基种类、数目很多，所以该技术所产 生的 标记数目是无限多的； （2）典型的AFLP分析，每次反应产物的谱带在 50-100条之间，所以一次分析可以同时检测 到多个座位，且多态性极高； （3）表现共显性，呈典型孟德尔式遗传； （4）分辩率高，结果可靠； （5）目前该技术受专利保护，用于分析的试剂盒 昂贵，实验条件要求较高。但也存在假阳性 带出 现频繁、技术复杂、成本高等缺点。 DateDate4141 （三）RAPD标记 RAPD标记的基本原理是利用合成的随机引物（ 一般为810个碱基）对基困组DNA进行PCR 扩增 ，然后电泳检测PCR产物的多态性。 DateDate4242 RAPD标记的主要特点有： （1）不需DNA探针，设计引物也无须知道 序 列信息； （2）显性遗传（极少数共显性），不能鉴别 杂合子和纯合子； （3）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自 显影等技术； （4）DNA样品需要量少，引物价格便宜， 成本较低； （5）实验重复性较差，结果可靠性较低。 DateDate4343 （四）SSR标记 又叫微卫星DNA标记，它是指基因组中存 在的由2-5个核苷酸为重复单位组成的长 达几十个核苷酸的串联重复序列，广泛 分布于真核生物基因组中。 SSR标记具有共显性、高多态性和易于检 测等优点，是一种理想的分子标记， DateDate4444 SSR标记的主要特点有： （1）数量丰富，广泛分布于整个基因 （2）具有较多的等位性变异； （3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子 ； （4）实验重复性好，结果可靠； （5）由于创建新的标记时需知道重复序列两 端的序列信息，因此其开发有一定困难，费 用也较高。 DateDate4545 （五）SNP标记 也是以PCR技术为基础的分子标记技术。它是指不同 生物个体基因组DNA序列之间单个核苷酸的差异，这种差 异可以通过设计特异PCR引物扩增和电泳检测显示出来。 SNP标记是根据基因组测序结果发展起来的，数量非 常丰富。检测SNP的最佳方法是新近发展起来的DNA芯片 技术。 目前SNP作为一种的分子标记技术，已有2000多个 SNP标记定位在人类染钯体上，在稻和大豆等植 物上也发 展了一些SNP标记。 DateDate4646 DNA分子标记在生物技术中的应用 lDNA分子标记是现代生物技术中应用的重要工具，其应 用主要包括以下几个方面： 构建高密度的遗传连锁图 ：在经典遗传学中由于遗传标记 的数量较少，只能建立稀疏且分布不均匀的遗传连锁图。 DNA分子标记数量丰富，为高密度遗传图谱的制作提供 了可能，促进DNA指纹的分析。 进行基本定位：基本定位就是寻找与目的的基因紧密连锁的 遗传标记并确定其在染色体上的位置，高密度遗传连锁图 的建立使目的基因的定位更为方便。 DateDate4747 遗传多样性和物种亲缘关系：分子图谱的构建和基因定位 更加有利于遗传多样性和物种亲缘关系的研究。遗传多 样性是品种遗传改良的基础。 种质鉴定和遗传背景分析：利用DNA分子标记可以鉴别品 种，评估品种纯度，分析农艺形状基因，分离和鉴别遗 传材料，确定染色体同源性，对异源染色体和染色体结 构畸变的检测。 育种中的分子标记辅助选择：长期以来，育种都是依植株 的表型性状进行选择的。DNA标记的出现使育种从表型 选择过渡到分子育种的新阶段。 DateDate4848 二、DNA测序技术 DNA序列分析方法主要有两种： 1. F. Sanger和A. R. Coulson发明的链末端测序法； 2. A. Maxam和W. Gilbert发明的化学消化法。 链末端测序法：一个测序反应一般可获得400-750个 核苷酸序列。 DateDate4949 （一）末端测序法： 利用DNA复制原理的一种测序方法，只适用于单链DNA 的测序，测序前要将待测DNA分子（单链）克隆到M13 载体中。 DateDate5050 1. 引物和DNA聚合酶： 引物与M13载体上的DNA序列互补结合。DNA的聚合需要Klenow片 段或其他测序酶。 2. 互补链的合成： 在反应体系中加入dNTPs，此外，还需加入一种被修饰的单核苷酸 ，即双脱氧核苷酸（ddNTPs）。它能加入到正在延长的核苷酸链中 ，但会导致链的合成终止。设置四个平行实验，分别在每个体系中 加入四种ddNTP（放射性标记），这样，每个体系的产物其末端均 为同一种ddNTP形成四组独立的末端核苷酸不同的链簇。 3. 电泳分离产物并读取DNA顺序： 凝胶电泳分离