《不同生姜提取物的》PPT课件.ppt

申申请请请请答答辩辩辩辩人：黄玉艾人：黄玉艾 指指导导导导教教师师师师：卢卢卢卢静静 2009 2009年年6 6月月5 5日日 内内 容 试验结试验结 果及结论结论 试验试验 方法 试验试验 中的关键关键 技术术 生姜提取物的制备备 背景介绍绍 前人对对生姜的药药理生理活性已研研究的比较较多， 生姜能维维持抗氧氧化酶系(SOD、过氧过氧 化氢氢酶、 GSH过氧过氧 化物酶)的活性，显显著降低大鼠的脂质质 过氧过氧 化反应应，降低血液中丙二醛醛（MDA）含量从从 而具有抗氧氧化活性。生姜还还含有较较多的挥发挥发 油， 可以抑制人体对对胆固醇的吸收，防止肝脏脏和血清清 胆固醇的蓄积积。 生姜 预预防和控制癌症的发发生和进进展一直是 全世界积极积极 探索的课题课题 。前人研研究的 生姜抗肿肿瘤原理有抑制肿肿瘤组织组织 中血管 的生成作用、通过过免疫调节调节 抗肿肿瘤、 对对癌细细胞转转移的影响响、通过细过细 胞毒作 用抗肿肿瘤等。抗肿肿瘤作用研研究相对较对较 少，研研究时间时间 也相对较对较 短。至今没没有 人用MTT法从从对肿对肿 瘤细细胞毒性的方面 对对生姜粗提物的抗肿肿瘤活性进进行研研究。 生姜中某些有效成分抗癌作用研究进进展 试验试验 内容 制备备生姜提取物 急性毒性试验试验 细细胞毒性试验试验 抗肿肿瘤试验试验 生 姜 提 取 物 的 制 备 鲜鲜姜 干燥 切片 Text 姜粉 急性毒性试验试验 7.12% 7.67% 细细胞相关试验关试验 姜粉的制备备 姜粉 50水浴3h 生姜醇提物 生姜水提物 10倍70%乙醇 煮煎3次 过滤过滤 浓缩浓缩 10倍水 水提法和醇提法水提法和醇提法 生姜水提物和生姜醇提物浓浓度 急性毒性急性毒性试验试验试验试验 1.66g/ml1.66g/ml （姜粉）（姜粉） 细细细细胞相关胞相关试验试验试验试验 1g/ml1g/ml （姜粉）（姜粉） 试验中的关键技术 动动物实验实验 的灌胃技术术 细细胞培养技术术 细细 胞 复 苏苏 细细 胞 传传 代 培 养 细细 胞 冻冻 存 急性毒性试验试验 GB15193-03 食品安全性 毒理学评评价程 序和方法进进 行最大耐受量 试验试验 试验试验 原理 细细胞毒性以及 抗肿肿瘤试验试验 MTT法 试 验 方 法 急性毒性试验试验 急性毒性试验选试验选 取健康小鼠60只，每 组组10只，为为雄性空白对对照组组、雄性 水提组组、雄性醇提组组、雌性空白对对 照组组、雌性生姜水提组组和雌性生姜 醇提组组。 采用小鼠经经口灌胃，按体重给药给药 ， 0.2ml/10g，灌胃两次。 基于MTT法的细细胞试验试验 细细胞毒性试验试验 HL-7702人正常 肝细细胞系 抗肿肿瘤试验试验 BEL-7404人肝癌细细胞系 SMMC-7721人肝癌细细胞 系 接种 用胰蛋白用胰蛋白酶酶消化，制成消化，制成细细细细胞胞悬悬悬悬液，然后以液，然后以 每孔每孔100100微升接种于微升接种于9696孔板，孔板，COCO 2 2 培养箱内孵育培养箱内孵育2424小小时时时时 染毒 每孔加入每孔加入4040微升的受微升的受试试试试物，作用物，作用24h24h后后 加 M T T 再加入再加入1010微升的微升的MTTMTT，4h4h 显显色 弃上清，每孔加入弃上清，每孔加入150l150l的的DMSODMSO，震，震荡荡荡荡， 溶解甲儹溶解甲儹颗颗颗颗粒，于粒，于酶酶标仪标仪标仪标仪 上上读读读读取取490nm490nm处处处处的吸光度的吸光度 值值值值 MTT法操作步骤骤 试 验 结 果 灌胃后性别对小鼠长势的影响 在急性毒性试验试验 中，灌胃一周后，小鼠无中毒和死亡现现象， 通过过分析灌胃一周后体重增长长的数值数值 ，我们们可以看到：空 白组组之间间差异异不显显著，雄性组与组与 雌性组间组间 的差异异也不显显著 （P0.01），但是与对应与对应 的空白组组之间间的差异显异显 著。 灌胃后提取方法对对小鼠长势长势 的影响 浓浓度水提物醇提物水提物醇提物 g/ml（ 姜粉 ）OD值值OD值值抑制率抑制率 0.003160.2814 0.3020 0.25%0 0.010.2773 0.2755 1.72%2.35% 0.03160.2741 0.2750 2.84%2.53% 0.10.2704 0.2663 4.16%5.63% 0.3160.1151 0.2009 59.20 %28.80% 10.0410 0.0167 85.47 %94.09% 生姜水提物和生姜醇提物各剂剂量组组OD值值及抑制 率 在细细胞毒性试验试验 中以10为为底0.5的对数为组对数为组 距，两种两种 提取物均设设置六个剂个剂 量组组，作用于人正常肝细细胞系。 加入生理盐盐水的阴阴性对对照组细组细 胞的状态状态 加入生理盐盐水的阴阴性 对对照组组的细细胞生长状长状 态态良好，结构清结构清 晰， 边缘边缘 整齐齐，细细胞外围围 有光晕晕，折光性好 不同剂剂量的生姜水提物作用后细细胞的生长长状 态态 不同剂剂量的生姜醇提物作用后细细胞的生长长状态态 浓浓度水提组组醇提组组 水提 组组醇提组组 g/ml（ 姜粉 ）OD值值OD值值抑制率抑制率 0.003160.2814 0.3020 0.25%0 0.010.2773 0.2755 1.72%2.35% 0.03160.2741 0.2750 2.84%2.53% 0.10.2704 0.2663 4.16%5.63% 0.3160.1151 0.2009 59.20 %28.80% 10.0410 0.0167 85.47 %94.09% 生姜提取物各剂剂量组组OD值值及抑制率 低低浓浓浓浓度度组组组组的的细细细细胞状胞状态态态态与阴性与阴性对对对对照照组组组组相似，毒性很小，相似，毒性很小， 低于低于0.1g/ml0.1g/ml的抑制率小于的抑制率小于5.63%5.63% 抗肿瘤试验浓度设置及实验结果 受试试物名称代码码 浓浓度 以姜粉计计 BEL OD均 值值 SMMC OD均 值值 BEL 抑制率 SMMC 抑制率 生姜水提物1 WEG 10.1g/ml0.031 0.003 68.462 92.711 生姜水提物2 WEG 20.01g/ml0.083 0.013 14.744 69.679 生姜醇提物1 EEG 10.1g/ml0.027 0.009 72.308 78.134 生姜醇提物2 EEG 20.01g/ml0.037 0.014 61.923 66.764 环环磷酰酰胺CTX0.01g/l0.050 0.026 48.846 39.359 纯肿纯肿 瘤细细胞0.098 0.043 ODOD值值值值越高越高说说说说明明肿肿肿肿瘤瘤细细细细胞活性越胞活性越强强，ODOD值值值值越低越低说说说说明明肿肿肿肿 瘤瘤细细细细胞被胞被杀杀杀杀死的越多，死的越多，该组别该组别该组别该组别 抑制抑制肿肿肿肿瘤效果越明瘤效果越明显显显显。 不同浓浓度生姜提取物对对BEL-7404抑制作 用 *表示与BEL比较较P0.05, *表示与BEL比较较P0.01; #表示与BEL比较较P0.05, #表示与CXT比较较P0.01 对对于BEL- 7404肿肿瘤细细胞 系，有水提一 组组，醇提一组组 ，和醇提二组组 三个实验组个实验组 的 抑制效果好与与 环环磷酰胺组酰胺组 。 不同浓浓度生姜提取物对对SMMC-7721抑制 作用 *表示与SMMC比较较P0.05, *表示与SMMC比较较P0.01; #表示与SMMC比较较P0.05, #表示与CXT比较较P0.01 生姜提取物 对对SMMC的 抑制效果比 BEL还还要略 好一些，有 四个实验组个实验组 的抑制效果 好于环环磷酰酰 胺胺 提取物对对人正常细细胞和肿肿瘤细细胞抑制率的比 较较 人正常肝细细胞人肝癌细细胞 受试试物浓浓度 HL-7702（% ） BEL-7404 （%） SMMC-7721 （%） 生姜水提物10.1g/ml4.1668.46292.711 生姜水提物20.01g/ml1.7214.74469.679 生姜醇提物10.1g/ml5.6372.30878.134 生姜醇提物20.01g/ml2.3561.92366.764 环环磷酰酰胺0.01g/L-48.84639.359 通通过与细过与细过与细过与细 胞毒性胞毒性试验试验试验试验 中生姜提取物中生姜提取物对对对对正常正常细细细细胞的抑制率比胞的抑制率比较较较较，发现发现发现发现 0.1g/ml0.1g/ml和和0.01g/ml0.01g/ml浓浓浓浓度的生姜提取物，度的生姜提取物，对对对对正常正常细细细细胞的抑制率均胞的抑制率均远远远远远远远远 小小 于于对肿对肿对肿对肿 瘤瘤细细细细胞的抑制率。胞的抑制率。 结 论 1 生姜浓缩浓缩 提取物 对对小鼠经经口的最 大耐受量大于 66.67g/kg 2 细细胞毒性试试 验验 生姜水提物的半 数抑制