《CR的技术原理》PPT课件.ppt

基 因 工 程 商丘师范学院 马原松 第五章 PCR的技术原理 第五章 PCR的技术原理 教学目的和要求:通过本章的学习，要求学生了解利用 PCR 技术原理所衍生出来的技术方法的种类和工作原理 ，达到能够自觉合理地利用 PCR 技术为科研服务， PCR 鉴定和诊断；理解PCR介导的克隆和PCR介导的 诱变；掌握PCR 技术的基本原理、基本操作程序，引物 设计方法。 重点、难点： PCR 技术的基本原理；引物设计方法； PCR介导的克隆。 教学方法：讲授、讨论、计算机辅助教学等 本章思考题： 1.简述PCR反应的工作原理。 2.循环次数是否越多越好？为何？ 3. 进行PCR引物设计时应注意哪些原则? 4.进行PCR产物克隆的方法主要有哪些？ 主要参考资料: 1.吴乃虎主编. 基因工程原理(第二版) .北京:科学出版社,2002. 2. J.萨姆布鲁克等.分子克隆实验指南(第三版).北京:科学出版社, 2002. 3. F. 奥斯伯等著.精编分子生物学实验指南.北京:科学出版社, 2005. 4. 美 本杰明卢因编著.基因.北京:科学出版社,2007. 5.何光源主编.植物基因工程实验手册.北京:清华大学出版社,2007 第一节 PCR技术原理和工作方式 1983年，由Cetus 公司的Kary Mullis 建立； 1988年耐热的Taq DNA聚合酶被发现和应用，把PCR推 向了实用阶段，成为PCR发展史上又一里程碑； 1989年，美国专利局授予PCR技术专利； 1989年，PCR技术被science杂志评选为伟大的技术 发明； 1989年为DNA聚合酶的分子年； 1993年，Mullis 获得诺贝尔化学奖。 计算机技术使循环操作实现了程序化和自动化，简化了 PCR操作程序，使之迅速得到推广。 PCR技术是方法学上的一次革命，生物学及医学领域的一 个里程碑，巨大的推动作用。 一、PCR的基本原理 1、 PCR的基本原理 PCR(多聚酶链式反应)是一种体外扩增特异DNA片段 的技术，是分子克隆技术中最常用的技术之一，是在模板 DNA、引物和dNTP的存在下依赖于DNA聚合酶的酶促反 应。由一对引物介导,通过温度的调节，使双链DNA变性为 单链DNA、单链DNA能与引物复性（退火）成为引物- DNA单链复合物、在dNTP存在下,DNA聚合酶能使引物沿 单链模板延伸成为双链DNA（引物的延伸）；这种热变性- 复性-延伸的过程，就是一个PCR循环；一般通过20-30个 循环之后，就可获得大量（106倍）的介于两个引物之间的 特异DNA片段。 PCR技术的特异性取决于引物和模板结合 的特异性。 一、PCR的基本原理 1、 PCR的基本原理 变性(denaturation)：在某些理化因素作用下，DNA 分子互补碱基对之间的氢键断裂，使DNA双螺旋结构松散 ，变成单链。 变性因素：加热、酸、碱、紫外线等。 一、PCR的基本原理 1、 PCR的基本原理 Tm (melting temperature)：50%DNA分子变性时温 度称为熔解温度/解链温度。 一般生理条件下，Tm在85 -95之间。 影响Tm值的因素： （G+C）含量增加，Tm值增高 溶液的离子强度高，则Tm增加（离子键的形成增多）； 甲酰胺的浓度增加，则Tm下降（使碱基对间的氢键不稳 定，可避免G、C含量高的DNA在高温变性时引起断裂而失 活）； 若DNA组成比较单一，则变性发生在狭窄的温度范围内. Tm值的计算： Tm = 69.3+0.41(G+C) % Tm = 4(G+C) +2(A+T) （DNA自身复性 几率 ）;引物的最佳退火温度Tm-5 ，引物的量、引物的 长度。 一、PCR的基本原理 2、 PCR扩增步骤： 引物的延伸（新链DNA的合成）7075，3060s （2kb) 首次循环：引物从3端开始延伸，延伸片段的5端为 人工合成引物是特定的， 3端没有固定的终止点，长短不 一。 第二个循环：引物与新链结合，由于后者5端序列是 固定的末端，意味着5端的序列就成为此次延伸片段3端 的终止点。 N个循环后：由于多数扩增产物受到所加引物5端的限 定，产物的序列是介于两种引物5端之间的区域。 P=1-(n+1)/2n 3 5 3 35 5 53 3 5 5 3 一、PCR的基本原理 2、 PCR扩增步骤： 循环次数： 当其它参数确定之后, 循环次数主要取决于DNA 浓度 。一般而言25-30轮循环已经足够。循环次数过多,会使PCR 产物中非特异性产物大量增加。 在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变 成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效 应。平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物 继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数 ，在平台期前结束反应，减少非特异性产物。 通常经25-30 轮循环扩增后, 反应中Taq DNA 聚合酶已经 不足, 如果此时产物量仍不够, 需要进一步扩增,可将扩增 的DNA 样品稀释103-105 倍作为模板, 重新加入各种反应底 物进行扩增, 这样经60 轮循环后, 扩增水平可达109-1010 。 二、PCR反应体系 1、 缓冲液： 缓冲液除了提供pH缓冲能力外，还有一些辅助反应进 行的成分，主要是Mg2+。 Mg2+浓度的高低会影响扩增的特 异性和产率，直接影响扩增的成败，最佳的镁离子浓度对于 不同的引物对和模板都不同。为了确定最佳浓度, 可以用0.1 -5mmol/L的递增浓度的Mg2+ 进行预备实验,选出最适的 Mg2+浓度。 2、脱氧三磷酸核苷 （dNTP） 脱氧三磷酸核苷是DNA合成的底物，高浓度dNTP易产 生错误掺入；但浓度过低，将降低反应产物的产量。四种脱 氧三磷酸核苷酸的浓度应相同，如果其中任何一种的浓度明 显不同于其它几种时（偏高或偏低），就会诱发聚合酶的错 误掺入作用，降低合成速度，过早终止延伸反应。 PCR中常用终浓度为200M的dNTP 二、PCR反应体系 3、模板 模板是将要被复制的核酸片段DNA或RNA，因此模板是 PCR 的关键，模板的质量是PCR 成功的先决条件，一般要 有较高的纯度，最好用纯化的DNA样品，（粗品应避免混有 蛋白酶、核酸酶）。另外模板的数量也会直接影响扩增的效 果，一般要求含量合适，3105分子数（1g）（提高产量 ，减少非特异性扩增）； 4、DNA聚合酶 选择聚合酶要从实验的具体要求考虑，高保真的酶成本 较高，如果要求严格时选用。Taq DNA聚合酶被看做是低保 真度的聚合酶，因为其缺少3到5外切核酸酶（校正）活性 ，但是产量高，是目前实验室应用最多的酶。使用带有3到 5外切核酸酶活性的热稳定聚合酶可以提高保真度。但是这 些聚合酶的产量比Taq DNA聚合酶低。 二、PCR反应体系 5、引物（primers) 引物是人工合成的两段 寡核苷酸序列，一个引物与 感兴趣区域一端的一条DNA 模板链互补，另一个引物与 感兴趣区域另一端的另一条 DNA模板链互补。 引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1 到 0.5M。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。 3 5 53 二、PCR反应体系 5、引物（primers) 在整个PCR体系中, 引物占有十分重要的地位。具有定 位、定向、定范围的作用。 定位 一对引物设计时，分别与一条模板结合，并且是与靶 序列3端侧翼碱基互补，引物只能结合在所识别链的靶序列 3端。 定向 由于DNA聚合酶的53合成特点，引物的3端得以 延伸，两引物延伸方向相对并均指向靶序列中央。 定范围 引物之间的距离决定了扩增靶序列的大小及特定范 围： 引物A+引物B+AB间序列。 引物设计好坏与PCR结果密切相关。 二、PCR反应体系 5、引物（primers) 引物的设计原则 (1)长度： 16-30bp ，一对引物。 过短-非特异性扩增增加，竟争并抑制特异扩增， 从 而降低扩增的灵敏性； 过长-易形成稳定的杂合体或链内互补，使引物的延 伸温度超过Taq酶的最适温度，同时还使检测成本增加。 (2)G+C含量：占40-60%，Tm值在55 以上。 GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度 不利于提高PCR的特异性； GC含量太高也易于引发非特异扩增。 二、PCR反应体系 5、引物（primers) 引物的设计原则 (3)碱基的随机分布： 引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或 聚嘧啶的存在。 3末端最佳选择为G 和C；但不应超过3个 连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。 但现在观点认为，在3端尽可能选用T，少用G或C，这样可 更好的避免假引发。（错配率： T G或C A ） (4)引物自身及引物之间不应存在互补序列 引物自身和引物之间不能有连续3个碱基的互补。 引物自身存在互补序列，会使引物自身折叠成发夹结构 ，使引物本身复性，这种二级结构会影响引物与模板的复性 结合。 两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3端的 互补重叠以防止引物二聚体的形成。 二、PCR反应体系 5、引物（primers) 引物的设计原则 (5)引物的5端可以修饰，而3端不可修饰： 引物的5端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影 响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5 端修饰包括：添加酶切位点；生物素、地高辛、荧光等标记 ；引入蛋白质结合DNA序列；引入启动子序列等。 引物的延伸是从3端开始的，不能进行任何修饰。 现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行，目前使用 最广泛的是Primer Premier 5.0 、Oligo 6、Dnasis、 Omiga、Dnastar。 三、PCR反应 第二节 PCR产物的克隆 一、在PCR产物两端添加限制性酶切位点 通常情况下，PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接 ，但其连接效率效低。由于PCR引物的5末端可以增加一些 非互补碱基，因此可以在两引物的5末端设计单限制酶或双 限制酶切位点。这样得到的PCR产物用限制酶消化产生粘性 末端，即可与有互补粘端的载体DNA重组。在设计引物时， 除了考虑正常的特异性序列外，在引物的 5末端添加酶切位 点的序列以及保护序列。 第二节 PCR产物的克隆 二、A/T克隆法 A/T 克隆法是主要针对于Taq DNA 聚合酶扩增的产物。 Taq DNA 聚合酶具有末端转移酶的活性，可在 DNA 片段的 3 末端添加一个核苷酸，通常为 A(图8-2) 。因此，Taq DNA 聚合酶扩增的产物可与 T-载体进行粘端互补连接，达到高效 克隆的目的。 A T PCR产物 T-载体 添加T碱基的方法： 用末端转移酶和底物 ddTMP 可以产生单个 T 的突出末端； 有些识别不对称序列的限制性内切酶，在切割 DNA 后可直接 产生一个 3 突出的 T ； 用 Taq DNA 聚合酶和高浓度的 dTTP 也可产生 3 突出的 T . 第二节 PCR产物的克隆 三、平末端DNA片断的克隆 1、 pPCR-Script Amp SK（+）克隆载体 该载体将pBluescript SK（+）噬菌粒多 克隆位点中的Xba和 Spe位点改成 Srf位 点。克隆 DNA 片段时，先将载体用 Srf切成 线状，再与目标 DNA 片段混合作连接反应。在 连接体系中除了添加 T4 DNA 连接酶外，还加 入 Srf 酶。当载体发生自连后， Srf酶又会 将其切开，载体就处于酶切与连接的动态平衡中 。当载体与目标 DNA 片段连接后，将总体的反 应平衡向载体与目标 DNA 片段连接这个方向倾 斜。形成大量的有效连接。 第二节 PCR产物的克隆 三、平末端DNA片断的克隆 2、 pCR-Blunt 克隆载体 载体在 lacZ 基因的下游融合了一个 ccdB 基因（图8- 6），该基因对大肠杆菌是致死的。在克隆外源平末端 DNA 片 段时，先将载体切成线状，再与目标 DNA 连接，转化大肠杆 菌。如果载体发生自连，获得这些载体的大肠杆菌宿主细胞就 会死亡，只有当外源 DNA 片段与载体连接后， ccdB 基因的表 达受到阻断，重组质粒才能在大肠杆菌中存在下来。 第二节 PCR产物的克隆 四、长片段的 PCR 扩增 在常规的 PCR 反应中，其产物一般在 2kb 以下。在 PCR 反应中，随着扩增片段的延长，扩增效率随之降低。为了 提高扩增产物的长度，一方面改进缓冲体系，另一方面采用混 合 DNA 聚合酶，即主体使用扩增效率高、延伸能力强的 Taq DNA 聚合酶；少量使用具有 3-5 外切活性的高温 DNA 聚合 酶，及时切除不匹配碱基的掺入。这样可使扩增长片段 DNA 有 效实施。 第三节 PCR扩增未知DNA片断 染色体步查：指从生物基因组或基因组文库中的已知序列 出发，逐步获得或探知其相邻的未知序列或与 已知序列呈共线关系的目的序列的核苷酸组成 的方法和过程。 第三节 PCR扩增未知DNA片断 一、反向PCR 反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA， 也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧 合成DNA。选择的引物虽然与核心DNA区两末端序列互补， 但两引物3端是相互反向的。扩增前先用限制性内切酶酶切 样品DNA，然后用DNA连接酶连接成一个环状DNA分子，通 过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段。为了提高反应 的特异性，可再进行一次巢式PCR。（巢式PCR是指在PCR 完成后，以PCR产物为模板，根据引物内侧的序列设计引物 所作的PCR） 第三节 PCR扩增未知DNA片断 一、反向PCR 已知序列未知序列未知序列 限制酶 限制酶 连接酶 第三节 PCR扩增未知DNA片断 一、反向PCR 反向PCR的不足是： 需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适 的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能 在非酶切位点切断靶DNA。 大多数真核基因组含有大量中度和高度重复序列，这样 ，通过反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。 第三节 PCR扩增未知DNA片断 二、利用接头的PCR 将基因组DNA 用限制性内切酶切割，然后将序列已知的 接头片断连接在酶切片断两端，以提供PCR需要的另一端引 物。根据已知序列设计的引物和根据接头序列设计的引物， 可以将已知序列侧翼的未知序列扩增出来。 第三节 PCR扩增未知DNA片断 三、热不对称交错PCR 热不对称交错PCR：通过3个嵌套的特异性引物分别和简 并引物组合进行连续的PCR循环，利用不同的退火温度选择 性地扩增目标片段，分离与已知DNA序列邻近的未知序列的 方法。所获得的片段可以直接用做探针标记和测序模板。 基本原理是利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特 异性引物（p1，p2，p3，约20bp），用它们分别和1个具有 低Tm值的短的随机简并引物（AD，约14bp）相组合，以基 因组为模板，根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的 温度循环，通过分级反应来扩增特异引物。 简并引物:指碱基序列不同，但有相同碱基数的一组针对某一基因相 同区域的寡核苷酸混合物。 第三节 PCR扩增未知DNA片断 三、热不对称交错PCR 第四节 其他PCR技术 一、RT-PCR 检测RNA一般采用特殊的扩增技术。先将RNA反转录成 cDNA，接着以cDNA为模板进行PCR扩增，这一技术称为反 转录-PCR(RT-PCR) mRNA 逆转录酶 杂化双链 聚合酶 cDNA PCR扩增 第四节 其他PCR技术 一、RT-PCR RACE（cDNA末端快速扩增）是一种获得转录5或3未 知序列的方法。不象普通RT-PCR那样使用两个序列特异性 的引物，RACE使用一个序列特异性的引物和或者mRNA的 poly(A)尾（3 RACE）或者加到cDNA末端的多聚同聚体（ 5 RACE）。 RACE的产物可以用来克隆，直接测序，制备探针或连接 在一起得到全长cDNA。 第四节 其他PCR技术 第一链引物(GSP1)同mRNA退火 在引物引导下反转录合成 cDNA 使用RNase混合物降解RNA，并纯 化cDNA链 用末端转移酶在cDNA链3末端添 加同聚物尾C 使用特异性引物(GSP2)和复合引物 AUAP(3端同聚物G，5端带有酶 切位点的固定序列)，对加尾的cDNA PCR扩增 巢式PCR扩增，提高特异性产物 5-RACE 第四节 其他PCR技术 一、RT-PCR 差别显示PCR（DD-PCR）：以PCR为基础的、能快速有 效地检测相似生物材料的基因表达谱差异的方法。 DD-PCR的基本原理：利用随机引物扩增所有的mRNA， 来自不同mRNA的扩增产物大小不相同，经测序胶电泳可显 示差异表达的cDNA片段。重新扩增并克隆这些片段，用其作 探针就可以从cDNA库或基因组库筛选全长的cDNA或基因组 克隆。 DD-PCR步骤：(1)反转录(RT)：将mRNA反转录成 cDNA；(2)PCR：扩增cDNA；(3)测序胶电泳显示差异片段 ；(4)差异片段再扩增克隆；(5)确证差异并测序：Northern Blot及序列分析。 第四节 其他PCR技术 二、多重PCR（复合PCR） 在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出 多个核酸片段的PCR反应，叫多重PCR。 多重PCR可用于等位基因的鉴定。目前主要用于多种病 原微生物的同时检测或鉴定和病原微生物，某些遗传病及癌 基因的分型鉴定。 第四节 其他PCR技术 三、RAPD （随机扩增多态性DNA） 建立于PCR基础之上，使用 一系列具有10个左右碱基的单链随 机引物，对基因组的DNA全部进行 PCR扩增，可随机扩增出大小不同 的DNA片断，产生DNA片断的多态 性，即DNA指纹。 DNA的提 取 PCR反 应 凝胶电 泳 选择随机引 物 图谱分 析 第四节 其他PCR技术 四、AFLP （扩增片段长度多态性） 首先利用可产生粘性末端的限制性内切酶酶切研究对象的基 因组序列，产生不同长度的酶切片段。然后，将这些酶切片段 与含有与其有共同粘性末段的人工接头连接，形成模板。为达 到选择扩增的目的，再在模板末段添加具有选择性核苷酸（2 3个）的不同引物，然后PCR扩增，结果只有那些两端序列与选 择性核苷酸配对的酶切片段被扩增。最后将被扩增的片段再高 分辨率的测序胶上电泳，这样其多态性即根据扩增片段的长度 与数量的不同而被分开。 第四节 其他PCR技术 五、实时定量PCR 实时定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基 团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循 环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA (or cDNA) 的起始浓度进行定量的方法。 实时定量PCR原理： 扩增呈指数增长,在反应体系和条件 完全一致的情况下,样本DNA含量与扩增产物的对数成正比,由 于反应体系中的荧光染料或荧光标记物(荧光探针)与扩增产物 结合发光,其荧光量与扩增产物量成正比,因此通过荧光量的检 测就可以测定样本核酸量。 第四节 其他PCR技术 五、实时定量PCR 荧光定量 PCR是通过荧光定 量PCR仪来完成的。荧光定量 PCR仪是一种带有激发光源和 荧光信号检测系统的PCR仪,通 常配有电脑系统及相应的分析软 件。 实时荧光定量 PCR是目前确 定样品中DNA (或 cDNA) 拷贝 数最敏感、最准确的方法。 第四节 其他PCR技术 六、标记PCR（LP-PCR） LP-PCR是利用同位素、荧光素等对PCR引物5端进行标 记，据此检测目的基因的存在与否，与常规PCR相比更为直 观，省去了限制性内切酶酶切及分子杂交等繁琐步骤，而且一 次可以同时分析多种基因成分，因而特别适合于大量临床标本 的基因诊断。目前该方法只对PCR产物进行定性鉴定。 标记引物 观察 PCR产物 cDNA 末端核酸转移酶末端核酸转移酶 3GGGG3GGGG 55 CCCC CCCC 锚定引物锚定引物 3GGGG3GGGG 55 CCCCCCCC 3GGGG3GGGG CCCCCCCC 第四节 其他PCR技术 七、锚定PCR 锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾 （polydG),与同聚物尾配对的3锚定引物（带有限制性内切位点 polydC)一起作PCR扩增。锚定PCR主