《CR结果PAL》PPT课件.ppt

1 234 1号孔：空白对照 2号孔：下游P7 P8（405bp） 3号孔：上游P5 P6（314bp) 4号孔：marker 2000 1000 750 500 250 100 2010,12,24 上样量5ul 引物20、21（P7,P8) ，加样0.5ul产物405bp 引物 18.19 加样 0.5ul产 物 314bp P5,P6 Marker750bp 加样2ul共 60ng其余 Marker均 20ng. 2010年12月31号产 物回收跑胶照片，还 剩产物14.5ul，约 580ng(根据亮度按 20ng/0.5uL计算） To do: 用zhh 2010.1.10的P1P2,P3P4， （ P5P6和P7P8： 40ng/mL） P1P2:P5P6=2:3，P3P4:P7P8=2:5, P1P2和P3P4做1:3dilution， 2nd PCR, P5P6:0.5uL,P7P8:0.9uL 2010.12.31 marker1234 1号：体系中模板p78多 加了0.3ul。条带为 p3p4+p7p8（1605bp ） 2号：体系中用了新 buffer。无条带。 P3p4+p7p8 3号：同2号,无条带。 P1p2+p5p6 4号：体系中模板p56多 加了0.3ul。条带为 p1p2+p5p6(1814bp) 2000 1000 750 500 250 100 2011、1、20 分析： 1、4号都出现了正常条带，说明体系中模板多加 适量对结果影响不大，但是产物产量偏低。 2、3号均未出现条带说明可能是所更换的buffer 有一定问题，需要进一步验证。 2011、1、21 重复上述PCR，所用buffer为新的，和上述3、4 号的一致，仍未出条带，得出结论，可能是buffer的 原因，进一步探究。 12 3 1号产物P2P5(1814kb) 2号产物P4p8(1605kb) 3号marker 750kb 上样量1ul，产物量较 小为20ng/ul共1ug，1 号有杂带，2号条带周 围较模糊 2011,3,4 改进PCR条件，切胶回收 需要25ug（in 20uL）注：两种产物同时提取的总量 1234561号：原方法p25 加样1ul 2号：原方法p48 加样1ul 3号：原方法 buffer为zhh的 加样1ul 4号：新方法p25 加样1ul 5号：新方法p48 加样1ul 2011.3.11 6号：marker 2ul 估计：1,2号孔为20ng/ul，4号孔 为30ng/ul，5号孔为65ng/ul 1234567 1号:marker 2ul 5、6、7号： p4p8 各1ul 2、3、4号： p2p5各1ul 分别为温度48.7 、54.2、 Mg离子浓度 2.0mol/L 估计30ng 1号:marker 2ul 1、2、3号： p4p8 各上样1ul 亮度和最暗的 marker差不多亮 度，估计20ng,3 管各50ul,总量 1ug 1234 20110412 1号：marker 2ul 2号：p78 上样1ul 3号：p56上样1ul 1 23 123 1号： p78 上样0.5ul 2号： p56上样0.5ul 3号：marker 2ul 估计量 marker 1234 2000 1000 750 500 250 100 欲扩增P4P8，温度梯度 1、温度51.7 （52 ） 2、温度53.8 （ 54 ） 3、温度55.7 （ 56 ） 4、温度58.2 （ 58 ） 括号里是预设的，括号外的是实 际PCR仪设计的 其余条件为改变，所用程序为最初 的程序，电泳上样1ul,marker 2ul 条带很特殊