饲料中沙门氏菌的监测概况及常规检测技术应用.pptx

饲料中沙门氏菌监测情况及 常规检测技术的应用 常规沙门氏菌检测技术的应用 背景 1 饲料中沙门氏菌污染情况 2 3 汇报提纲 背景 沙门氏菌的检测是各国检验机构对多种食 品的必检项目之一 公共卫生学 上具有重要 意义的人畜 共患病之一 引起食物中 毒的重要病 原菌 在各类细菌 性的食物中 毒中沙门氏 菌常居前列 不得 检出 饲料卫 生标准 食品安全 国家标准 欧盟 ICMSF CAC 沙门氏菌 DANIEL ELMER SALMON, (1850-1914) 美国兽医微生物和病理学 家。是美国授予的第一位兽 医学博士。1884年任美国农 业部畜牧局首任局长。他首 次从病猪中分离出猪霍乱沙 门氏菌。在医学微生物中通 用的沙门氏菌一词，就是为 纪念他而以他的名字命名 的。 沙门氏菌（ Salmonella） 一群形态、培养、生化反应 和抗原构造相类似的杆菌， 种类繁多。 已发现2500多种血清型，我 国目前发现的有200多种血清 型。 沙门氏菌主要生物学性状 革兰氏阴性短杆菌 ，无芽孢和荚膜， 有鞭毛（除鸡白痢 沙门氏菌、鸡伤寒 沙门氏菌外），大 多数具有毛。 需氧或兼性厌氧；普通营养琼脂上 生长良好。 7-45均可生长，最适温度37， 最适pH6.8-7.8。 抵抗力 60 20-30min即被杀死 在水中能生存23周 在粪便中可生存12个月 在冰中能生存3个月 沙门氏菌生物学特性 发酵葡萄糖，麦芽糖，甘露醇和山梨醇产气 不发酵乳糖、蔗糖和侧金盏花醇 不产吲哚、V-P反应阴性 不水解尿素和对苯丙氨酸不脱氨 伤寒沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌及一部分鸡白痢 沙门氏菌发酵糖不产气，大多数鸡白痢沙门氏菌不发 酵麦芽糖。 O抗原 Vi抗原 H抗原 血清学特性 O抗原：为脂多糖，多糖部分决定其特异性，耐热(100 、2.5h不破坏)，其特异性不易丧失或变异。 H抗原：H抗原存在于鞭毛中，蛋白质，不耐热，60、 30-60min及酒精作用均可破坏其抗原性，能抵抗甲醛。 Vi抗原：是一种N-乙酰-D-半乳糖胺糖醛酸聚合物，60 加热1h即破坏其凝集性和免疫原性。 血清学特性 DHL:无色半透明有黑色中心或几乎全为黑色 酚红黄绿：菌落呈红色透明，同时培养基颜色变红 HE：蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色 科马嘉显色培养基：呈紫色或紫红色 沙门氏菌在不同选择琼脂平板上的菌落特征 沙门氏菌的危害 沙门氏菌 伤寒和副伤 寒 急性肠胃炎败血症 内毒素 对人的危害 据调查，沙门氏菌是美国食物中毒致死的主要原因。美国每年大约报告40000例 沙门氏菌感染病例。但实际的感染人数可能要达20倍以上，因为许多轻型病人可能 未确诊，据不完全统计，每年大约1000人死于急性沙门氏菌感染。 沙门氏菌对动物的危害 畜禽食用含有沙门氏菌的饲料，就可引起疾病或 带菌。一般情况下畜禽肠道带菌率比较高。当动物 因患病、衰弱、营养不良、疲劳以致抵抗力降低时 ，肠道中的沙门氏菌即可经肠系膜淋巴结和淋巴组 织进入血液引起全身感染，甚至死亡。 （1）急性败血症 多见于断奶前后（24月龄）仔猪，主 要由猪霍乱沙门氏菌引起。发热，拒食，耳根，胸前，腹下 等处皮肤出现紫斑，后期见下痢，呼吸困难，咳嗽跛行，经 14d死亡。病死率可达2040。 （2）亚急性和慢性 表现为：体温升高，畏寒；结膜炎， 顽固性下痢，伴以消瘦，脱水而死；部分病猪在病中后期皮 肤出现弥漫性湿疹。 猪沙门氏菌病的症状 （1）雏鸡感染：引起败血症，可造成大批死忙 ；病鸡 表现虚弱，口渴，食欲不振，腹泻，发育迟滞等。 （2）成年鸡：最常见产蛋量降低或停止。另外可引起 卵巢炎，可在卵黄内带菌而传给幼雏。 禽沙门氏菌病的症状 （1）犊牛：体温升高，呼吸困难；排出血丝粪便；病 期延长时，腕和跗关节可能肿大，有时伴有支气管炎和 肺炎症状。 （2）成年牛：常有高热，昏迷，食欲废绝，呼吸困难 ，体力迅速衰竭；怀孕母牛多数发生流产。 牛沙门氏菌病的症状 传播途径 最主要的传播途径是水、土壤和饲料 病菌随人和动 物的粪尿等排 泄物及病死畜禽 来污染土壤和 水源 因宰杀患病、 带菌的畜禽而 造成病菌的散布 ，致使健康动 物的胴体和环 境受到污染 饲料和饮水的 污染，是导致 畜禽沙门氏菌 病以及相互传 染的主要原因 危害程度分类 中华人民共和国卫生部人间传染的病原微生物名录 序号 病原菌名称 危害程 度分类 实验 活动所 需生物安全 实验 室级别 学名中文名 大量活菌操 作 1 Salmonella choleraesuis 猪霍乱沙门菌 第三类 BSL-2 2Salmonella enterica肠沙门菌第三类BSL-2 3 Salmonella meleagridis火鸡沙门菌第三类BSL-2 4 Salmonella paratyphi A,B,C 甲、乙、丙型副伤 寒沙门菌 第三类 BSL-2 5 Salmonella typhi伤寒沙门菌 第三类 BSL-2 6 Salmonella typhimurium鼠伤寒沙门菌 第三类 BSL-2 加强饲料的卫生管理，防止沙门氏菌的污染， 不仅是发展畜禽生产的需要，也是减少人类感染沙 门氏菌、预防食物中毒的一个重要环节。 意义 Torres G J等2011年对西班 牙3844个饲料样品检测发现 ，沙门氏菌的检出率为4.8% 美国对12个牛场的295份饲 料样品进行沙门氏菌检测， 检出率为9.8% 国外沙门氏菌污染情况 常规检测技术的应用 传统检测 方法 分子生物学方法 免疫学方法 常规沙门氏菌检测技术 国内现行标准 分子生物学方法 免疫学方法 传统检测方法 GB/T13091-2002 （培养法） GB/T 4789.4-2010 （培养法） GB/T29642-2012（ PCR法） SN/T 1059.7-2010（ 实时荧 光PCR法） GB/T 22429-2008 （酶联免疫法） DB34/T816-2008（ 免疫色谱反应法） 传统检测方法 前 增 菌 选 择 性 增 菌 分 离 培 养 生 化 鉴 定 血 清 学 鉴 定 传统检测方法 原理 沙门氏菌 生化特性 修复受损伤 的沙门氏菌 饲料中含 大量杂菌 主要培养基、试剂、 血清 缓冲蛋白胨水 （BPW） 氯化镁-孔雀 绿增菌液（RV ） 亚硒酸盐胱氨 酸增菌液（SC ） 酚红黄绿琼 脂 DHL琼脂 营养琼脂 色氨酸肉汤 赖氨酸脱羧酶 肉汤 尿素酶 氰化钾培养基 甘露醇 山梨醇 -半乳糖苷 沙门氏菌 O，Vi，H型血 清 主要仪器设备与材 料 高压灭菌锅 干热灭菌箱 培养箱 水浴锅 接种环 培养瓶或三角瓶 量筒 平皿 25g样品 225ml BPW 36 16-20h 1ml BPW增菌液 +10ml SC MM增菌液在42、 SC增菌液在36 各培养24h 0.1ml BPW增菌 液+10ml MM 分别从MM和SC增菌 液中取1环，接种到 酚红黄绿和DHL 琼脂上培养 在36培养20-24h DHL琼脂在 36培养24h 分别选择性培养基 上挑选可以菌落进 行TSI等生化鉴定 TSI生化试验 底层产H2S 底层产酸 斜面产碱 斜面底层 产酸 产碱 底层产酸 斜面产碱 底层产H2S 产酸产气 产酸产气产H2S 只在TSI产碱的 情况下可判定 无沙门氏菌， 其余任何情况 均需进行生化 鉴定 生化鉴定 O.5个麦氏浊浊 度的菌悬悬液 依次在每个安瓿 瓶中滴加菌悬悬液 23滴。 第一步 第二步 第三步 生化鉴定试剂套装 色氨酸肉汤经 36，18 24h培养后滴 加靛基质试剂 ，片刻观察结 果，阳性为玫 瑰红色 色氨酸脱羧酶及对 照和氰化钾及对照 转种结束后需滴加 液体石蜡覆盖试验 管方可进行培养 靛基质试验 +时补做甘 露醇山梨醇 试验，试验 阳性后进行 血清学鉴定 TSI-时，进行 ONPG试验， ONPG阴性时 进行血清学鉴 定 H2S+、靛基质- 、尿素-、KCN-、赖氨酸+后进行血清学鉴定 结果判定 其他商品化生化鉴定系统 VITEK GNI+ 应用一系列小的多孔的聚苯乙烯卡片进行测 试，卡片含有干燥的抗菌药物和生化基质。先制 备一定浓度的欲鉴定菌株的菌悬液，然后将菌悬 液接种到各种细菌的小卡上，将其放入具有读数 功能的孵箱内，每隔一定时间，仪器会自动检测 培养基的发酵情况，并换算成能被计算机所接受 的生物编码。最后由计算机判定，打印出鉴定结 果。 VITEK 6-8h 商品化生化鉴定系统 API 20E API 20E 生化鉴定是根据快速酶促反应及代谢 产物的检测技术发展而来的一种细菌编码鉴定法 ，广泛应用于临床、食品中革兰氏阴性杆菌的快 速鉴定。 API 20E 18-24h API 20E 第1位数第2位数第3位数第4位数第5位数第6位数第7位数结 果 判 定 O N P G A D H L D C O D C CI T H 2 S U R E T D A IN D V P G E L G L U M A N I N O S O R R G A S A C M E L A M Y A R A O X 1 2 41 2 41 2 41 2 41 2 41 2 41 2 4 反应 结果 - + + + +- - - - + + + - +- + - 沙 门 氏 菌 应得 数值 0 2 41 2 40 0 0 0 0 41 2 41 0 40 2 0 组合 编码 6 7 0 4 7 5 2 BD PhoenixTM 100 商品化生化鉴定系统 2-8h 血清学鉴定 阴性 阳性 分子生物学方法 GB/T29642-2012 饲料中沙门氏菌的快速检测方法-聚合酶链式反应（PCR）法 SN/T 1059.7-2010 进出口食品中沙门氏菌检测方法-实时荧 光PCR法 现行标准 PCR技术原理 PCR技术是是通过模拟 体内DNA复制的方式， 在体外选择性地将DNA 目的片段进行短时间内 大量扩增的技术。 25g样品 225ml BPW 36 16-20h 1ml BPW增菌液 +10ml SC RVS增菌液在41.5、 SC增菌液在36 各培养243h 0.1ml +10ml 大豆蛋白 胨肉汤（ RVS） 煮沸离心 PCR扩增 电泳检测 GB/T29642-2012 - 主要仪器设备、培养基、试剂 PCR仪 离心机 微量移液器 电泳仪 凝胶成像仪 分析天平 缓冲蛋白胨 水 大豆蛋白胨 肉汤 亚硒酸盐胱 氨酸增菌液 引物 Premix Taq DNA 聚合酶 琼脂糖 Marker 2000 TAE缓冲液 溴化乙锭（ EB） -GB/T29642-2012 DNA模板制备方法 方法一：热裂解法 取选择性增菌液1ml于离心管中，12000r/min离心10min，灭菌去离子水洗 涤2次，最后用0.2ml灭菌去离子水悬浮，煮沸10min，将离心管迅速转移至冰 浴中冷却，10000r/min离心5min，取上清液作为模板。 方法二：试剂盒 可选用商业试剂盒。 -GB/T29642-2012 PCR扩增 反应体系 反应程序 -GB/T29642-2012 PCR结果分析及判定 结果判定：在阴性对照无条带，阳性对照有条带的前提下， 如果待测样品再330处未出现相应大小的扩增条带，则可报 告未检出沙门； 如果待测样品在330bp处出现扩增条带，则为疑似阳性样品 ，需用GB/T 13091进行确证，最终结果以后者为准。 -GB/T29642-2012 实时荧光PCR原理 实时荧光PCR是指在PCR反应体系 中加入荧光基团，利用荧光信号 积累实时监测整个PCR进程，最后 通过阳性对照、Ct值及扩增曲线 对模板进行定性分析的方法。 25g样品 225ml BPW 36 16-20h 1ml BPW增菌液 +10ml SC RVS增菌液在41.5、 SC增菌液在36 各培养243h 0.1ml +10ml 大豆蛋白 胨肉汤（ RVS） 煮沸离心 反应体系 扩增曲线 实时荧光PCR 法 主要仪器设备、培养基、试剂 荧光定量 PCR仪 离心机 微量移液器 恒温水浴 锅 高压灭 菌 锅 缓冲蛋白 胨水 亚硒酸盐 胱氨酸增菌 液 四硫磺酸 钠孔雀绿 增菌液 引物 探针 DNA提取试 剂盒 Taq DNA聚 合酶 -SN/T 1059.7-2010 模板DNA的制备 方法一：热裂解法 取增菌液1ml，置于离心管中，5000r/min离心5min，灭菌生理盐水洗涤2次 ，最后用1ml灭菌去离子水悬浮，煮沸15min，10000r/min离心5min，取上清 液作为模板。 方法二：试剂盒法 参照美国Promega公司生产的DNA抽提试剂盒，或其他等效产品操作程序进 行。 -SN/T 1059.7-2010 实时荧光PCR扩增 反应体系（25ul） 反应条件 10PCR缓冲液2.5ul dNTPs1ul 上游引物1ul 下游引物1ul 探针1ul 模板2ul Taq DNA 酶0.5ul 双蒸水16ul 1个循环9510min 40个循环 9515s 6530s -SN/T 1059.7-2010 样品Ct值35时，报告沙门氏菌筛选 阳性； 样品Ct值介于35-40之间，重复一次， 如果Ct值40，且曲线有明显的对数 增长期，报告沙门氏菌筛选阳性，否 则，报告未检出； 样品Ct值40时，报告未检出。 筛选阳性的样品按SN0170的规定进行 确证，以确证结果为准。 结果分析及判定 -SN/T 1059.7-2010 其他分子生物学技术 环介导 等温扩 增技术 （ LAMP ） 多重 PCR技 术 基因芯 片技术 免疫学方法 现行标准 GB/T 22429-2008食品中沙门氏菌、肠出血性大肠埃 希氏菌O157及单核细胞增生李斯特氏菌的快速筛选检 验 （酶联免疫法） DB 34/T 816-2008饲料中沙门氏菌的测定 （免疫色谱反应法） 技术原理 免疫学检测是基于免疫学理 论基础，根据抗原抗体的特异 性反应而进行检测的技术。 沙门氏菌特异性抗体是快速 定性检测的基础。 主要仪器设备、培养基、试剂 酶联免疫 分析仪 漩涡混合 器 均质器 恒温培养箱 高