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项目11： 乙型肝炎病毒标志物的检测【目的要求】1、 熟悉ELISA的原理扩操作方法。2、 掌握乙肝病毒标志物的临床意义。【实验内容】乙型肝炎病毒目前培养困难，临床主要测定乙型肝炎病毒的各种抗原和抗体做辅助诊断。实验室常用对流免疫电泳法及反向间接血凝法。目前临床上多用固相酶联免疫吸附试验(ELISA)。 【原 理】使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，将特异性抗-HBs吸附于固相载体表面，当加入待检血清中相应的HBsAg时，结合形成Ag-Ab复合物，加入过氧化物酶标记的抗-HBs酶结合物，有酶相应底物存在情况下，产生颜色变化，用肉眼判读或酶标仪测定结果。间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。先将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质；后加稀释的受检血清，其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。【材 料】1包被液：0.2M pH9.6的碳酸盐缓冲液 2洗涤液：0.02M pH7.4的PBS-Tween20(0.05)液3酶结合物：用辣根过氧化物酶标记的抗HBs 4酶抗体稀释液：0.01M pH7.4的PBS-Tween20(0.05)液 5酶底物液：邻苯二胺(OPD)10mg溶于pH5.0的磷酸盐-柠檬酸缓冲液25m1中，临用前加入30H2O212ml。新鲜配制，避光 6中止液：2M H2SO47待检血清、阳性血清、阴性血清8聚苯乙烯微量板，微量移液器，吸头等 【方 法】1包被：用包被液稀释抗-HBs为50ugml，加入微量板100ul/孔，置40过液后，用洗涤液洗3次每次35min。2加样：加入稀释为150的待检血清100ml孔每个标本作2孔，同时作阳性、阴性和空白对照，置37 2h后洗涤3次。3加酶结合物：加入经适当稀释的酶结合物100ul孔，置37 2h后洗涤3次。 4加底物液100ul/孔，避光置于37 2030min。5中止反应：加1滴孔中止液。 【结 果】肉眼判读时，待测孔颜色与阴性对照一样或更浅，判为阴性。若明显加深，呈黄棕色，判为阳性。用酶标仪检测时，PN值21为阳性，21为阴性。P为被检标本OD值，N为阴性对照OD值。附录：（一）乙肝病毒表面标志检测的临床意义1称大三阳，为慢性肝炎，处于活动期。有较强的传染性。2称小三阳，为慢性携带者，乙肝已趋向恢复，传染性弱，如持续时间过久，可转化为肝癌。 3感染阶段或慢性乙肝表面抗原携带者，传染性弱。4感染过乙肝病毒，具有一定的免疫力，为不典型的恢复期或为急性乙肝感染期。5乙肝感染，为肝炎恢复期，少数人仍有传染性。6去有乙肝感染或现在正处于急性感染。7前打过乙肝疫苗或以前感染过乙肝。8性乙肝恢复期，以前感染过乙肝。9急性感染早期或者慢性乙肝表面抗原携带者，传染性弱。 10慢性乙肝表面抗原携带者，较易转阴，或者是急性感染，趋向恢复。11早期乙肝感染，或慢性携带者，传染性强。 12急性乙肝感染趋向恢复，或者为慢性携带者。 （二）PCR方法检测病原微生物 多聚酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是一种模拟天然DNA复制过程，在体外扩增特异性DNA（或RNA）片段的新技术。本实验是将待检双链DNA经94高温变性成单链作模板，然后加入一对人工合成的寡核苷酸引物，引物分别与待扩增DNA片段的两端互补，经55低温退火，引物与模板互补结合。在72条件下，结合于模板上的引物在DNA聚合酶的催化下，利用反应体系中的4种dNTP为原料，按碱基互补配对的方式延伸合成两条新的DNA链。经过20-30个周期后，特异的目的DNA可扩增百万倍以上。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后即可观察到特异的扩增条带。PCR方法操作简便，灵敏度高，可检测出少至0.1pg的目的DNA。目前已广泛应用于多种病原微生物及寄生虫的检测。【材 料】1无菌双蒸水、石蜡油、溴化乙锭210PCR反应缓冲液 325mmol dNTP混合液 4引物1，引物2各50pmolu1 5模板DNA 65Uul Taq DNA聚合酶 【仪 器】1PCR扩增仪 2电泳仪3紫外线分析仪 【方 法】1在0.5m1EP管中，加入以下成分：10PCR反应缓冲液 5u1 引物1 2ul 引物1 2ul 模板DNA 10u1dNTP混合液 4ul Taq DNA聚合酶 1ul无菌双蒸水 加至 50ul 混匀, 加50 ul石蜡油，防止样品水分蒸发。2将反应管置于PCR仪中，94变性4