实验十一 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质.doc

实验十一 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质一、 目的1、 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳技术；2、 掌握同工酶遗传标记的分析方法。二、 原理聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis)，是以聚丙烯酰胺凝胶为作为支持介质的一种常见电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺（Acr）和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合法以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速器。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。 由于同工酶的酶蛋白分子的大小和结构不同，携带的电荷种类和数量不同，所以可用凝胶电泳将它们一一分开。在适宜酶催化反映的条件下提供酶作用的底物，再利用特殊的显色反应以显示产物的形成或底物的消失，就可以看到经电泳分离后的同工酶谱带。同工酶的鉴定过程通常如下：1、从植物样品中提取粗酶液；2、聚丙烯酰胺凝胶电泳把样品中酶带分开； 用专一作用底物和特殊染料把需要分析的酶染色，显示同工酶谱。同工酶技术是通过电泳和组织化学方法进行特异性染色而把酶蛋白分子分离，并将其位置和活性直接在染色区带以酶谱的形式标记出来。分离同工酶的方法有：电泳法、层析法、酶学法和免疫学其中以电泳法最为普遍，电泳法中又以垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率为最好。聚丙烯酰胺凝胶电泳有三种物理效应：1、样品的浓缩效应；2、凝胶的分子筛效应；3、一般的电泳分离的电荷效应。三、 仪器、设备、药品及材料仪器、设备：电泳仪、电泳槽、离心机、移液管、装凝胶用的玻璃管（内径为5mm、长度为90mm）。 垂直板电泳装置图药品：三羟甲基氨基甲烷（Tris）、四甲基乙二胺（TEMED）、丙烯酰胺（Acr）、价差双丙烯酰胺（Bir）、甘氨酸、过硫酸铵（AP）、蔗糖、溴酚蓝、联苯胺、过氧化氢。材料：鸡爪菜（棒菜）和红苋叶片和其他植物的叶片。四、 内容1、 样品的提取不同品种或种间的植物，取发育时期相同，组织相同的样品，制备酶粗提液。一般取样0.5g，或在恒温条件下发芽的幼苗35个，置于研钵中，加入0.10.5ml水研磨匀浆、后将样品移至小离心管中离心（3000rpm）15min，取上清液，混入等体积的50%的蔗糖溶液，电泳前可在冰箱中保存。2、 聚丙烯酰胺凝胶系统的配制A液：1mol/l Hcl 48.0 ml，Tris 36.4 克 ,TEMED 0.23 ml加水至100 ml pH 8.3。B液：丙烯酰胺 28.0克 ；甲叉双丙烯酰胺 0.735 克 加水至100 ml。C液：过硫酸铵（用前配制）1.4 % 。配胶：A：B：C：H2O = 1：2：0.4：4.6配胶后立即灌好装胶的玻璃管3、 点击缓冲液配制Tris 30.0克；甘氨酸14.4克加水至1000毫升、pH 8.3、使用时稀释10倍。4、 染色液配制过氧化物酶染液醋酸联苯胺溶液5毫升，3% H2O2 毫升，H2O 93 毫升。5、 加样和电泳各根凝胶管加入0.05毫升的样品酶粗提液0.05毫升。加一小微滴0.005%溴酚蓝，上下电泳槽加电极缓冲液后在低于15摄氏度气温中，每管电流2mA进行电泳，当溴酚蓝迁至凝胶下端0.5-1厘米是停止电泳。电泳时间3-4小时。6、 用长针头注射器注水法自凝胶管中取出凝胶，凝胶要完整，不能断裂。7、 染色：将完整的凝胶条置于中号试管中，加入染色液，浸入整条凝胶，室温下染色20-30分钟，呈现酶带后取出凝胶，用水漂洗终止染色。8、 带型清楚的胶应作摄影记录或做扫描测定，胶晾干后还作永久保存。五、 数据记录1、将各胶柱中酶带条数、宽度、着色深浅和移动距离填入表中。胶柱样品可见酶带数由近及远记录酶带迁移距离宽度着色深浅相对迁移率（主要酶带）是否有特殊酶带1233、 选择比较组分胶柱中、着色最深的酶带或特殊酶带（即该组分特有的酶带），计算酶带的相对迁移率Rf值Rf=（某酶带迁移距离）/（溴酚蓝指示剂迁移距离）六、 结果讨论及分析1、 配制缓冲液系统对电泳的影响：在SDS-PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris-HCL缓冲系统，浓缩胶是PH6.7，分离胶PH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris-甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其PH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中PH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。2、样品的处理：根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。 1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。 2）带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul 20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。 3）非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。3、SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用。聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关； 制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择trisHCL系统，TEMED与AP：AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基磺酸钠（SDS）：阴离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。4、提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径. 聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。 一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的蛋白质电泳技术手册P82-103。 5.“ 微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？ 主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。 处理办法：待其充分凝固再作后续实验。 6. “皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？ 主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。 处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。 7.带出现拖尾现象可能原因。 主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。 处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。 8. 为什么带出现纹理现象？ 主要是样品不溶性颗粒引起的。 处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。 9. 什么是“鬼带”，如何处理？ “鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。 处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。 10. 为什么溴酚蓝不能起到指示作用？ 我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。 处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。 11. 为什么电泳的条带很粗？ 电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。 处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）；适当降低电压； 12. 为什么电泳电压很高而电流却很低呢？ 这种现象一般初学者易出现。比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。 处理办法：电泳槽正确装配即可。 13. 浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？ 这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。 14. 凝胶时间不对，或慢或快，怎么回事？ 通常胶在30MIN-1H内凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS剂量不够或者失效。APS应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。 如果凝的太快，可能