外施水杨酸对镉胁迫下小麦叶片中抗氧化酶活性及丙二醛含量的影响毕业论文.doc

外施水杨酸对镉胁迫下小麦叶片中抗氧化酶活性及丙二醛含量的影响摘 要：采用水培法, 研究水杨酸对镉（cd）胁迫下小麦叶片抗氧化酶活性、丙二醛（mda）和叶绿素含量以及根长的影响。结果表明：就sa浓度方面而言，0.5 mmol/l sa的完全培养液能明显提高50 mmol/l和100 mmol/l cdcl2对小麦幼苗影响下超氧化物歧化(sod)、过氧化物酶(pod)以及过氧化氢酶( cat)的活性，并且能明显缓解对小麦幼苗根长的影响。然而，1.0 mmol/l sa的完全培养液却随cdcl2浓度的上升而降低了超氧化物歧化(sod)、过氧化物酶(pod)以及过氧化氢酶(cat)的活性，并且对小麦幼苗根长影响没有缓解作用。但是1.0 mmol/l sa的完全培养液却能够明显增加叶绿素的含量。此外，在等浓度的cdcl2溶液条件下，0.5 mmol/l sa的完全培养液比1.0 mmol/l sa的完全培养液更能提高小麦叶片中抗氧化酶活性，更能降低叶片中mda的含量；就培养时间而言，第7天时抗氧化酶增加的效果和丙二醛降低的效果没有第3天时明显，但叶绿素的含量却随培养时间的延长而增加。关键词：小麦；水杨酸；cdcl2effects of exogenous salicylic acid on antioxidase activities and malondialdehyde (mda) content of wheat leaf under cadmium stresskong ming-zhu, college of life sciences, anhui normal university abstract: by using hydroponics method, antioxidase activities, the content of malondialdehyde (mda) 、chlorophyll and root length of wheat leaf under cadmium stress are studied in the condition of salicylic acid (sa) on wheats. the results show: as far as sa is concerned，0.5 mmol/l sa can significantly improve the super oxide (sod), peroxidase (pod) and catalase (cat) activities, and can significantly alleviate the influence of root length with 50 mmol/l and 100 mmol/l cdcl2 on wheats. however, 1.0 mmol/l sa reduces the super oxide (sod), peroxidase (pod) and catalase (cat), and the influence of root length can not be alleviated. but 1.0 mmol/l sa can increase the content of chlorophyll. in addition, in the condition of the equal cdcl2 solution, 0.5 mmol/l sa can raise the wheats resisting oxidase activity and the content of chlorophyll, and can reduce the content of mda in the leaf blade more than 1.0 mmol/l sa; as far as training time is concerned, the amount of antioxidase and the reduction of mda in the 7th day are supiror to ones in the 3rd day, but the content of chlorophyll is increasing accompanied by the extension of exposure time.key words: wheat; salicylic acid; cdcl2 1 引言土壤的污染及其预防和解决一直是生态学家、农业学家热议的话题。近几十年来，农药、化肥的长期使用以及不当的农业生产方式，使得一些农田和果园面临着严重的重金属污染威胁，不少农田土壤重金属含量出现超标现象，其中，镉（cd）在农田土壤中的超标率甚高。镉(cd)是一种高毒性、持久稳定的环境毒物，是生物的非必需元素，不参与生物的结构组成和各种生命活动，但如果在体内累积将对生物产生毒害作用 1 。土壤镉污染首先会损伤植物根系，较高浓度的镉能干扰细胞的生理功能，引起代谢紊乱，严重时会导致细胞和植株死亡。根系生长在土壤中，土壤中的镉离子会导致质膜透性增大和膜脂过氧化，破坏细胞质膜的完整性，抑制根系质膜h+-atpase活性和根系对营养元素的吸收，干扰植物的生长发育，而且镉能通过食物链引进人体，会对呼吸道产生刺激，长期暴露会造成嗅觉丧失症、牙龈黄斑或渐成黄圈，镉化合物不易被肠道吸收，但可经呼吸被体内吸收，积存于肝或肾脏造成危害，尤以对肾脏损害最为明显。还可导致骨质疏松和软化，即土壤中的镉不仅会对农作物产生毒害作用 2 ，如抑制植物光合作用和蒸腾作用、干扰植物的代谢过程、加速植物衰老、影响农作物产量和品质 3, 4，而且能通过食物链引进人体从而引发多种疾病，日本曾因镉中毒曾出现“痛痛病”。因此，如何降低农作物镉毒害及其在谷物中的积累是当前亟待解决的问题。植物生长发育受激素和环境信号的调控。水杨酸( salicylic acid, sa)是植物体内普遍存在的一种新型的植物激素，能够增强植物在臭氧、低温、热胁迫、干旱、盐害和除草剂等非生物胁迫条件下活性氧清除能力，降低氧化损伤5, 6。许多植物感病后，其体内都会有大量水杨酸积累，水杨酸与系统抗性(systemic acquired resistance，sar)的形成密切相关。sar指在病原物诱导下植物产生的一种整体水平非专化抗性，对病原菌的再侵染，甚至对其他病原物的侵染均产生很强的抗性，是植物一种主动防御机制。植物sar的产生需要一系列信号的转导，水杨酸是激发sar的主要信号分子。重金属诱导的细胞抗氧化代谢活性属于普遍的胁迫反应。尽管高的抗氧化代谢活性在严格意义上不能表明cd的抗性，但这对重金属胁迫下植物的功能是益的，抗氧化活性低则会引起胁迫下植物的氧化损伤、膜质过氧化及膜渗漏。既然cd胁迫能够诱导小麦、萝卜、紫羊毛等植物体内活性氧累积7, 8，造成氧化损伤，那么sa能否减轻cd胁迫诱导的氧化损伤对小麦的伤害，国内外尚未见报道。本文以我国重要的粮食作物小麦为实验材料，研究了sa对cd胁迫下小麦影响的几个生理指标的测定，包括超氧化物歧化酶( sod )、过氧化物酶( pod)、过氧化氢酶( cat)、丙二醛（mda）、叶绿素以及根的长度的测定，旨在为预防小麦早期遭受重金属毒害提供理论依据。2 材料与方法2.1 试验材料供试材料为小麦(triticum aestivum l )。种子经hgcl2消毒10 min，25摄时度催芽24 h，选取萌发一致的种子进行hoagland溶液培养。2.2 试验方法2.2.1 材料处理 待小麦长到幼苗时，将小麦平均分成六组，对其中一组施用不含sa的完全培养液，并作为对照组；用含0.5 mmol/l sa的完全培养液分别培养剩余的其中两组，同时用含1.0mmol/l sa的完全培养液分别培养最后的两组，这四组小麦作为实验组。处理3d后, 在培养液中分别加入cdcl2， 使培养液含cdcl2浓度为50 mmol/l和100 mmol/l，取等量的两种浓度的培养液分别添加到上述六组小麦的培养皿中进行培养。cd处理后第3天和第7天分别取样及测定。2.2.2 酶液提取 sod、pod和cat各自粗酶液的提取 9, 10 ：取小麦叶片0.3g，加入10ml 50mmol/l ph7.8磷酸缓冲液，研磨后过滤，经10500r/min离心15min，上清液为sod粗酶提取液； 取小麦叶片0.3g，加入20mmol/l kh2po4 5ml，于研钵中磨成匀浆，以4000r/min离心15min，收集上清夜保存在冷处，所得残渣再用5ml kh2po4溶液提取一次，合并两次上清夜即为pod粗酶提取液；称取小麦叶片0.3g，加入0.2mol/l 4摄时度下预冷的ph7.8磷酸缓冲液2-3ml和少量石英砂于研钵中磨成匀浆，转入25ml容量瓶中,并用缓冲液洗研钵数次，合并冲洗液,并定容至刻度，混合均匀后将容量瓶置于5摄时度冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000 r/min离心15min，上清液即是cat粗酶液。mda 的提取：摘取同一处理的叶片数片，洗净擦干，剪成0.5厘米长的小段;称取同一处理叶片小段0.3g，放入研钵中，加入少量细石英砂和2ml蒸馏水，研磨成浆，将匀浆转移到试管中，在再用3ml蒸馏水分两次冲洗研钵，合并提取液，此为mda粗提取液。叶绿素的提取：称取小麦叶片0.3g，剪碎放入研钵中，加入少量细石英砂研成糊状，用80%丙酮水溶液分批提取叶绿素，直到残渣无色为止，将丙酮提取液过滤后定容至50ml。2.2.3 测定方法 sod 活性测定采用氮蓝四唑( nbt )光化还原法 9 ：在3 ml反应混合液中含有162ml dl-甲硫氨酸、0.6mledta-2na、5.4ml50mmol/l ph7.8磷酸缓冲液、6ml nbt溶液和6ml核黄素，加入50ul粗酶液，混合后放在透明试管架上，于光照培养箱中准确照光10分钟，迅速测定560nm下的吸光度，以不加酶液的照光管为对照，并以暗处理下的试管为空白对照，酶活性以u/g. fw表示。pod 活性测定采用愈创木酚法 9 ：反应混合液中含有100 mmol/l磷酸缓冲液（ph6.0）50ml，愈创木酚28ul，30%过氧化氢19ul。取反应混合液3ml和20mmol/l kh2po4 1ml，混匀，作为校零对照，另取反应混合液3ml和上述酶液1ml，混匀，立即开启秒表计时，于分光光度计470nm波长下测定a470值，每一分钟读取一次。以每分钟a470变化值表示酶活性大小，即以a470变化值/min.g.fw表示。 cat 活性测定采用紫外分光光度法10：取10ml试管3支，其中两支为样品测定管，另一支为空白管；样品测定管中分别加入0.2ml粗酶液，1.5ml0.2mol/l ph7.8磷酸缓冲液和1.0ml蒸馏水，而空白管中加入0.2ml煮死的粗酶液，1.5ml0.2mol/l ph7.8磷酸缓冲液和1.0ml蒸馏水。25摄时度后，逐管加入0.3ml0.1 mol/l h2o2，每加入一管立刻计时，并迅速倒入石英比色杯中，在240nm下测定吸光度a240，每一分钟读取一次，共记4min。以每分钟a240变化值表示酶活性大小，即以a240变化值.总粗酶量vt/(0.1.用去酶量v1.时间t.fw)表示。mda 含量采用硫代巴比妥酸显色法进行测定 9：在提取液中加入5ml 0.5%硫代巴比妥酸溶液，摇匀；将试管放入沸水浴中煮沸10分钟，(从试管中出现气泡时开始计时)到时间后，立即将试管放入冷水浴中；待试管溶液冷却后,3000r/min离心15min，取上清夜并测其体积(v)，以0.5%硫代巴比妥酸溶液为空白，测450nm、532nm和600nm出的吸光度(a450、a532、a600)，mda含量以mmol/g.fw表示。叶绿素含量采用丙酮法测定 9 ：在波长分别为663nm、645nm条件下测定提取液的吸光度（a663、a645），叶绿素a与叶绿素b以及总叶绿素浓度分别为chla，chlb和chlt表示。小麦根长测定采用一般测量法：待上述所有测定结束后，将每支培养皿中的所有幼株取出，分别测量根长，再计算平均数，并绘表。2.2.4 统计方法 所有数据为3次重复的平均值。3 结果与分析 3.1 sa对cd胁迫小麦幼苗抗氧化酶活性的影响3.1.1 sa对cd胁迫小麦幼苗sod活性的影响 由表1可知, cd胁迫3d和7d后小麦叶片sod活性均高于对照,但是在等浓度的cdcl2胁迫3d下，0.5 mmol/l sa比1.0 mmol/l sa对于增加叶片中的sod活性方面效果更好。cdcl2胁迫7d后，叶片中sod活性显著增加。植物体内sod活性的提高,有利于抵抗cd胁迫引起的氧自由基对植物的伤害。表1 sa+cd对小麦叶片中sod活性的影响table 1 effect of sa and cd on sod activity of wheat leafsa+cd (mmol/l) 0.0+50 0.0+100 0.5+50 0.5+100 1.0+50 1.0+100sod 第3天 107.48 20.33 244.00 212.05 183.00 49.38(u/g.fw) 第7天 145.24 78.63 310.81 214.95 231.13 124.903.1.2 sa对cd胁迫小麦幼苗pod活性的影响 不同浓度的sa对cd胁迫下小麦叶片pod活性的影响很小，但cd胁迫3d后小麦叶片pod活性均高于对照，而cd胁迫7d后小麦叶片pod活性却低于对照。总体上，在0.5 mmol/l sa时pod活性要高，cd胁迫第3天的pod活性比第7天的强。具体结果见表2：表2 sa+cd对小麦叶片中pod活性的影响table 2 effect of sa and cd on pod activity of wheat leafsa+cd (mmol/l) 0.0+50 0.0+100 0.5+50 0.5+100 1.0+50 1.0+100 pod 第3天 0.044 0.029 0.077 0.066 0.068 0.060 (u/min.g.fw) 第7天 0.048 0.034 0.043 0.040 0.042 0.038 3.1.3 sa对cd胁迫小麦幼苗cat活性的影响 cat主要存在于植物过氧化物酶体与乙醛酸循环体中，是清除h2o2的主要酶类，可催化如下反应：2h2o2 = o2 + 2h2o。由表3可知，cd胁迫3d和7d后小麦叶片cat活性基本均高于对照，但sa对cd胁迫3d时叶片cat活性几乎无影响，而在cd胁迫7d时叶片中的cat活性明显高于3d时的活性，结果如表3：表3 sa+cd对小麦叶片中cat活性的影响table 3 effect of sa and cd on cat activity of wheat leafsa+cd (mmol/l) 0.0+50 0.0+100 0.5+50 0.5+100 1.0+50 1.0+100cat 第3天 55.65 40.01 58.71 50.78 55.34 49.67 (u/min.g.fw) 第7天 57.61 48.90 70.32 66.09 56.33 47.75 sod、pod 和cat是植物体内抗氧化防御体系的主要酶类， 负责清除植物体内的氧自由基，使植物免受逆境胁迫的伤害。上述研究表明，在一定时间内，适当浓度的sa可提高小麦叶片中3种抗氧化酶的活性，减轻cd对小麦的伤害作用，而过高浓度的sa不仅不能缓解cd胁迫的伤害，反而加重了对小麦的伤害，说明小麦对cd耐受性的提高与sa的浓度、作用时间有关，即与抗氧化酶活性的增强有关。3.2 sa对cd胁迫小麦幼苗丙二醛含量的影响 丙二醛(mda)是植物细胞膜遭受逆境胁迫后产生的过氧化产物， 正常条件下植物细胞内mda含量很少，但当植物遭受逆境胁迫时细胞发生膜质过氧化， mda含量显著增加，且胁迫程度与mda含量呈正相关 11 。因此，mda已成为衡量植物受环境胁迫危害程度的重要指标。经sa处理后小麦叶片mda含量减少，并且在sa浓度为0.5 mmol/l时，叶片中mda的含量均低于对照，并且是最低，表明cd引发的膜质过氧化得到较好的缓解，从而保护植物体免受伤害，而浓度为0.5 mmol/l sa的缓解效果差，甚至伤害小麦。结果如表4：表4 sa+cd对小麦叶片中mda含量的影响table 4 effect of sa and cd on mda content of wheat leafsa+cd (mmol/l) 0.0+50 0.0+100 0.5+50 0.5+100 1.0+50 1.0+100mda 第3天 3.83 4.11 3.57 4.09 5.37 4.36(mmol/g.fw) 第7天 4.48 4.64 3.81 4.80 5.68 4.76 3.3 sa对cd胁迫下小麦叶绿素含量的影响 植物叶片内叶绿素的水平可以作为衡量光合能力强弱的一个指标， 亦可用来表征植物在逆境下受伤害的程度，大量研究表明cd处理可使叶绿素含量降低。cd胁迫3d和7d后小麦叶绿素含量均高于对照，并且cd胁迫小麦幼苗7d后，小麦叶片叶绿素含量增加比3d后的明显，尤其叶绿素a含量的增加，并且在施用1.0 mmol/l sa时，叶绿素a含量最多。具体结果见表5：表5 sa+cd对小麦叶绿素含量的影响table 5 effect of sa and cd on chlorophyll content of wheat leafsa+cd (mmol/l) 0.0+50 0.0+100 0.5+50 0.5+100 1.0+50 1.0+100第3天 chla 3.42 2.57 2.63 3.32 3.29 3.48 chlb 1.50 1.47 1.18 1.45 1.57 1.55chlt 4.92 4.04 3.81 4.77 4.86 5.03第7天 chla 2.35 2.20 3.19 3.48 3.28 3.06 chlb 1.43 1.49 1.54 1.67 1.64 1.55 chlt 3.78 3.69 4.73 5.15 4.92 4.67 3.4 第7天时sa对cd胁迫下小麦根长的影响 表6数据显示，cd胁迫7d后小麦根长均高于对照，当cd的浓度由50 mmol/l增加到100 mmol/l 时，对小麦根的伸长生长抑制作用逐渐增强，0.5 mmol/l sa可显著缓解50 mmol/l、100 mmol/l浓度cd对小麦根的伸长生长抑制作用，而1.0 mmol/l sa则不能缓解这种抑制作用。表6 sa+cd对小麦根长的影响table 6 effect of sa and cd on wheat root lengthsa+cd (mmol/l) 0.0+50 0.0+100 0.5+50 0.5+100 1.0+50 1.0+100根长root length(cm) 28.97 24.30 34.17 31.93 32.27 30.10 许多研究表明，逆境胁迫导致植物体内活性氧的产生和清除失衡， 造成植物体内自由基累积 12，对植物产生伤害。sa作为一类重要的信号分子， 能介导植物对非生物胁迫的适应反应。本次实验表明，当用一定浓度的sa完全培养液处理小麦幼苗时，植物叶片中抗氧化酶sod、pod和cat活性增强， 从而降低了cd诱导的叶片mda含量，起到增强小麦抵抗cd胁迫的作用。但随着cd胁迫时间的延长，这种缓解作用反而降低，并且随sa浓度的上升，对cd胁迫的缓解作用却呈下降趋势，说明对于小麦这种植物，sa对cd胁迫的缓解效应需要sa在特定的浓度范围内，并且在一定的时间内最佳。如果所用的sa超出上述浓度，对cd的缓解作用明显降低，甚至没有缓解作用。4 讨论sa是植物体中普遍存在的植物生长调节物质，能够激活一系列植物抗性防卫反应。作为植物生长调节物质一般都表现出“低促高抑”效应，这也为本文结果(表1、表2、表3、表4以及表6)所证实:低浓度sa对小麦幼苗叶片中抗氧化酶活性、丙二醛含量以及根长有一定的促进作用，当浓度为0.5 mmol/l时，促进作用最佳，高浓度则起抑制作用，这与高浓度sa是氧化剂可诱导氧化胁迫，导致细胞中活性氧积累，从而引起膜脂过氧化有关。然而，不同植物及同一植物的不同时期对sa的敏感性不同，而且即使是同一浓度若采用不同处理方式也会产生不同的效果，如表6可知，0.5 mmol/l sa可明显缓解镉对小麦根系生长的抑制作用，而1.0 mmol/l sa则抑制其根系的生长。这可能与不同植物体内sa受体蛋白水平不同及各异的信号转导途径有关。目前，有关sa诱导植物重金属抗性的机理的研究尚属起步阶段，从不同的植物材料研究所得结果也不尽相同，甚至互相矛盾 12。metwally等发现，sa预处理虽然能明显缓解大麦cd毒害，但并不改变大麦对cd的吸收及cd在植株中的分布 14 ；drazic等则认为，sa能够通过调节钾、镁等无机离子在植株中的分配而促进cd从根系向地上部的运输 15 。本文的研究结果表明，0.5 mmol/l sa培养3天能明显提高小麦叶片中sod、pod和cat活性氧清除酶活性，能够及时清除cd胁迫诱导产生的细胞毒害物质活性氧，减轻氧化胁迫程度，降低膜脂过氧化产物丙二醛在细胞中的累积，增强植株抗氧化能力，从而缓解cd对小麦的毒害。本次实验从小麦叶片入手研究，得出以上结论，那么如果以小麦根部为研究素材，根部的sod、pod和cat活性状况是否也如同上述结果？以小麦的种子为素材，它的结果又是什么？以其他植物为素材呢？等等。在我国已有不少生态学家以水稻为材料，研究出水稻在水杨酸等植物生长调节物质调节下的抗逆机制，这些对于植物抗逆性原理与过程的探索具有实际的指导意义。参考文献：1 李汝佳，李雪梅.水杨酸、脱落酸和过氧化氢对镉胁迫小麦幼苗光合及抗氧化酶活性的影响j.生态学杂志，2007，26(12)：2096-2099.2 钱永常，余叔文.so2对植物的氧化作用和植物的抗氧化作用j. 植物生理学通讯，1991，27(5)：326-331.3 秦天才，吴玉树，王涣校.镉铅及其相互作用对小白菜根系生理效应的研究j. 生态学报, 1998, 18(3)：320-325.4 秦秀