含报告基因的凋亡素基因真核表达载体构建研究.pdf

含报告基因的凋亡素基因真核表达载体构建研究 * 王福庆 1? 王庆宝2? 韩国新2 ( 1 . 滨州市人民医院, 山东 滨州 ? 256600 ; 2 . 泰山医学院, 山东 泰安?271016) 摘要: 目的? 构建含报告基因的凋亡素基因真核表达载体。方法? 对 pmd18t?vp3质粒进行 ecori和 ba mhi 双酶切, 回收 366 bp(含凋亡素基因完整序列 )片段。对增强型绿荧光蛋白 pegfp?c2质粒酶切, 回收载体大片段。 将凋亡素基因通过连接反应, 连接到增强型绿荧光蛋白 ( egfp)基因 c末端的终止密码前, 并使两者读框不移位, 构建成 pegfp?vp3质粒, 并对其进行酶切分析和测序鉴定载体结构。结果? 通过对构建的 pegfp?vp3质粒酶切、 电泳, 出现了 366 bp的电泳条带, 与凋亡素基因片段一致。凋亡素基因真核表达载体测序鉴定结果表明, 本研究合 成的凋亡素基因与 genbank中报告的凋亡素基因序列一致, 同源性为 100 % 。结论? 将凋亡素基因连接于增强型 绿荧光蛋白的 c末端, 成功构建了凋亡素? 增强型绿荧光蛋白表达载体 pegfp? vp3。 关键词: 凋亡素基因; 增强型绿色荧光蛋白; 真核表达载体; 构建 中图分类号: r348?文献标识码: a? 文章编号: 1004?7115( 2010)08?0567?04 study on construction of a eukaryon vector for expression of apoptin gene having reporting gene wang fu?qing1, wang qing?bao2, han guo?xin2 ( 1 . people s hospital ofb inzhou , binzhou 256600, china; 2 . taishanm edical college , ta ian 271016 , china) abstract : objective : to construct a eukaryn vector for apoptin gene(vp3) having reporting gene . m ethods : ecori and bamhi were used to cut pmd18t? vp3 plasmid ,and the seg ment having 366bp ( have apoptin gene intact sequence) was reclai med. ecori and ba mh iwere used to cutpegfp?c2 plasm id, and the big segmentwas reclai med as a vector . an ap? optin genewas linked to the c ter minalof enhanced green fluorescentprotein gene to generate pegfp?vp3 without reading frame shift . the structure of vectorwas identified by endonuclease analyzing and base sequencing. results : through endonu? clease and electrophoresis in the constructive pegfp?vp3, the segment having 366bp was obtaiined, which was consistent with the gene segment of apoptin. the base sequencing resultof eukaryn vector for apoptin gene indicated that the construc ? tive gene in the experi mentwas consistentw ith the gene in the genbank, andwas 100% homologous . conclusion: the apop? tin gene is linked to egfp gene and pegfp?vp3 is generated . keywords : apoptin gene ; enhance green fluorscence protein;eukaryn vector ;construction ? ? 近年来, 恶性肿瘤对人类的威胁日趋严重。传 统的肿瘤治疗方法存在其局限性, 人们正积极研究 新的肿瘤治疗方法, 以其获得更好的疗效。随着分 子生物学研究的飞速发展, 细胞生长、 分化、 凋亡的 机制逐渐被认识, 一种新的治疗方法? 基因治疗 正成为研究热点。其中, 凋亡素基因能够特异地诱 导肿瘤细胞凋亡, 在肿瘤治疗上的前景尤为突出。 凋亡素能选择性地诱导肿瘤细胞和转化细胞发生凋 亡, 而并不杀伤人和鼠的正常二倍体细胞, 因此, 被 认为是第一个真正意义上的选择性诱导肿瘤细胞凋 567 泰? 山? 医? 学? 院? 学? 报 journal of ta i shan med i cal college? vol ?31? no?8? 2010 *作者简介: 王福庆 ( 1978?), 男, 山东高青人, 主治医师, 硕士, 主要从事外科临床与基础研究。 亡而不损伤正常细胞的凋亡基因。凋亡素基因载体 的构建是凋亡素分子生物学特点研究及其在肿瘤基 因治疗方面应用的关键, 然而, 传统方法构建的凋亡 素基因表达载体不利于结果的观察。本实验应用基 因重组的方式构建了凋亡素基因的真核表达载体, 并引入了绿色荧光蛋白报告基因利于结果观察。 1? 材料与方法 1 . 1? 材料 p md18t? vp3质粒 (含凋亡素基因全序列 )由大 连宝生物公司根据 genbank中的基因序列合成; pegfp? c2质粒购于 clontech 公司; 宿主菌大肠 杆菌感受态细胞 dh5a购于 takara公司。 1 . 2? 方法 1 . 2 . 1? 质粒活化? 质粒穿刺菌 37 恒温孵箱过夜 培养。抗生素的 lb琼脂平板连续划线, 37 恒温 孵箱过夜培养。第二天, 挑取单一菌落, 放入 lb液 体培养基 37 恒温振荡器振荡摇菌过夜培养。 1 . 2 . 2? 质粒小量提取 ? 从过夜培养的菌液中取 1?5 m,l 12000 r/m in离心 30 s, 弃上清, 1 m l ste悬 浮细菌沉淀, 离心回收菌体。重复用 ste 漂洗菌 体, 离心去上清。100 ?l冰预冷的溶液 !混悬菌体, 振荡器充分震荡混匀。室温放置 5 m in 。加入 200 ?l溶液, 混匀, 冰浴 5m in 。加入 150 ?l冰预冷的 溶液 #, 混匀, 置冰浴 3 5m in , 溶液中出现白色沉 淀。 12000 r/m in室温离心 5m in 。用移液器将上清 液吸到另一 eppendorf离心管中, 在上清液中加入 1/2体积的 te饱和酚和 1/2体积的氯仿, 室温放置 2 3 m in。12000 r/m in室温离心 5 m in 。将上层水 相吸到另一 eppendorf离心管中, 加入 2倍体积的无 水乙醇混匀。 12000 r/m in室温离心 10 m in 。弃上 清, 消毒滤纸吸净管壁上的液滴, 室温下蒸发痕量乙 醇 10 5 m in。加入 47 ?l te 缓冲液及 5 ?l的 rnase a( 10mg /m l), 轻轻震荡使 dna溶解, 37 温 育 30 m in , - 20 冰箱保存。取 1 2 ?l dna样品 稀释后琼脂糖凝胶电泳, 鉴定该质粒是否为目的质 粒并判断质粒的纯度。 1 . 2 . 3? 琼脂糖凝胶电泳 ? 量取电泳缓冲液 ( 0 . 5 tbe)倒入三角烧瓶中, 加入琼脂糖, 加热。待凝胶 冷至 50 左右时 (手感容器能耐受 ), 在凝胶中加入 eb至终浓度为 0 . 5 ?l/m,l 摇匀后缓缓倒入制胶膜 中, 迅速放好梳子。凝胶的厚度在 3 5 mm 之间。 凝胶通常需要在室温中放置 30 45 m in 。凝胶完全 凝固后, 将凝胶放入电泳槽中, 加入电泳缓冲液, 液 面应高出凝胶表面 1mm。移去梳子和隔离板, 保持 点样孔完整。取适量 dna样品与其 1/5体积的 6 加样缓冲液混匀, 加样于加样孔内。以 5 v /cm 的电压进行电泳, 当溴酚兰电泳至适当位置时, 在长 波长的紫外灯下观察结果并用凝胶照相系统照相。 1 . 2 . 4? 限制性内切酶酶切反应 (双酶切反应 ) ? 在 0 . 5m l ep管中加入 60 ?l灭菌去离子水。加入 10 缓冲液 20 ?l 。加入质粒 dna 10 ?l 。分别加入 ecori 、 bamh i各 10 ?l 。离心, 混匀。放入恒温水浴 锅, 反应条件: 37 1 . 5 h , 65 15 m in 。取出后琼 脂糖凝胶电泳分析鉴定是否酶解。 1 . 2 . 5?dna目的片段的回收 ?对目的 dna 进行 琼脂糖凝胶电泳。在紫外灯下将单一的目的 dna 条带从琼脂糖凝胶中切下放入离心管中, 称重。向 胶块中加入 3倍体积溶胶液, 50 55 水浴 10 m in 。 将所得溶液加入吸附柱中, 13000 r/m in离心 30 60 s , 倒掉收集管重中的废液, 将吸附柱重新放入收集 管中。向吸附柱中加入 700 ?l加入无水乙醇的漂 洗液, 13000 r/m in离心 30 60 s , 倒掉废液, 将吸附 柱重新放入收集管中。向吸附柱中加入 500 ?l漂 洗液, 13000 r/m in离心 30 60 s, 倒掉废液。将离 心吸附柱放回收集管中, 13000 r/m in离心 2m in , 尽 量去除漂洗液。将吸附柱置于室温 1 2 m in , 彻底 地晾干, 以防残留的漂洗液影响下一步的实验。将 吸附柱放入一个干净的离心管中, 向吸附柱中间位 置悬空滴加适量 65 70 预热的洗脱缓冲液, 室温 放置 2m in 。 13000 r/m in离心 2 m in收集 dna液。 为了增加回收效率, 将得到的溶液重新加入离心吸 附柱中, 13000 r/m in再离心 1 m in收集 dna 液。 dna产物 - 20 保存。 1 . 2 . 6? 连接反应 ? 取 2 ?l含 100 200 ng的线性 载体 dna装入 0 . 5 m leppendorf离心管中。根据 1 ?g 1 kb dna% 1 . 5 pmol片段计算, 以载体片段与 基因片段末端数为 1 3的比例加入基因片段。 45 孵育 5 m in , 然后冰浴。加 10 连接缓冲液 2 ?,l混匀。加 t4dna链接酶 2 ?l( 5 u /?l)。 用 te( ph8 . 0)缓冲液补足 20 ?,l 12 保温 10 12 h , 或 16 过夜。取 2 ?l做细菌转化实验, 其 余置 4 保存。 1 . 2 . 7? 大量制备大肠杆菌感受态细胞 ( dh5a) ? 568 泰? 山 ? 医? 学? 院? 学? 报 journal of ta is han med i cal college? vol?31? no?8?2010 在无菌条件下, 用接种环将冻存的 dh5a空白菌涂 布于新鲜的无抗生素琼脂平板上, 倒置后放在 37 温箱中培养 16 20 h 。从平板中用无菌牙签挑取一 个单克隆, 转到含 3 m l lb培养基的 100 m l锥形瓶 中, 37 摇菌过夜。取菌液 1 m l接种到含 100 m l lb培养基的烧瓶中, 37 强烈震荡培养 3 h , 待 od600值达到 0 . 3 0 . 4时将烧瓶取出立即置冰浴 10 15m in 。将细菌转移到冰预冷的 50 m l离心管 中。 4 离心, 4000 r/m in 10m in回收细菌。弃去 培养液, 将管倒置于滤纸上 1 m in 。加用冰预冷的 0 . 1 mol/l氯化钙 10 m l重悬菌体, 置冰浴 30 m in 。 4 离心, 4000 r/m in 10 m in, 弃上清, 倒置于滤纸 上 1m in 。再加 4m l用冰预冷的 0 . 1mol氯化钙重 悬菌体 (重悬时操作要轻 ) 置 4 冰箱 12 24 h , 即 可用于转化。 1 . 2 . 8? 质粒转化大肠杆菌感受态细胞 ? 取新鲜感 受态细胞 100 ?l置于 10m l玻璃试管中。加入用于 转化的 dna( 10 ng以下 ), 轻轻混匀, 在冰上放置 30 m in 。 42 热休克 45 60 s。冰中放置 2 3 m in 。 加入无抗生素的普通 lb培养基 900 ?, l 使终体积为 1m l 。37 震荡培养 1 h( 160 225 r/m in), 用无菌 弯头玻璃铺菌器将 200 ?l菌液铺于含硫酸卡那霉 素的琼脂平板表面, 37 平放 20m in , 然后倒置过夜 培养。 1 . 2 . 9? 挑取单克隆筛选鉴定目的基因 ? 用灭菌牙 签分别挑取经过夜培养生长出的单一菌落, 放入分 别装有 10 m l含硫酸卡那霉素 lb培养基 5个无菌 试管中。将试管放入 37 恒温震荡器中过夜培养。 同步骤 3进行质粒小量提取。同步骤 5 、 6进行酶切 电泳鉴定筛选目的基因。将经过电泳初步筛选出的 质粒制成穿刺菌保, 送大连宝生物公司测序鉴定。 经测序鉴定证明完全构建成功, 再进行质粒 dna大 量制备。 2? 结 ? 果 2 . 1?p md18t? vp3质粒经双酶切后所得到 dna片 段 p md18t? vp3质粒含有凋亡素基因完整序列。 经 ecori和 bamh i的双酶切后, 产生约 2692 bp和 366 bp的 dna片段。其中 366 bp dna片段含有凋 亡素基因完整序列。酶切产物电泳后在约 370 bp 处可见一电泳条带, 见图 1。 图 1?p md18t?vp3质粒经 i双酶切后产生的 dna片段 2 . 2? 构建载体的连接产物转化大肠杆菌感受态细 胞形成转化菌落 ? 见图 2 。 图 2? 连接后转化菌落形成 2 . 3?pegfp? vp3的酶切电泳鉴定结果 挑取转化菌落分别进行扩增, 提取质粒后电泳, 使用 ecori和 ba mh i双酶切, 重组质粒经酶切成为 约 366 bp和 4800 bp两个片段 (图 3)。 图 3?pegfp?vp3质粒电泳鉴定结果 1为 d2000dna ladder ; 2 、 3、 5、 6为构建成功的 pegfp? vp3质粒; 4为未出现目的 dna条带的质粒。 2 . 4?pegfp? vp3测序结果 经酶切鉴定的质粒送大连宝生物有限公司测 序。通过序列分析鉴定, 所得到的序列与 genbank 中报道的序列完全一致同源性 100 % 。将测序结果 与原设计的 pegfp? vp3序列进行对比, 两者序列一 致, 凋亡素基因的阅读框与增强型绿荧光蛋白的阅 读框于 ecori位点相连, 无移码突变产生, 证明测序 之质粒为本研究需要构建的 pegfp? vp3 。 3? 讨? 论 凋亡素特异性诱导凋亡作用与其细胞定位间存 在密切关系 1, 在转化细胞和肿瘤细胞中, apoptin 569 泰? 山? 医? 学? 院? 学? 报 journal of ta i shan med i cal college? vol ?31? no?8? 2010 主要定位于细胞核, 并能诱导肿瘤细胞凋亡; 而在正 常细胞中, apoptin主要定位于细胞质中, 不能诱导 正常细胞凋亡。以往人们常用间接免疫荧光法研究 凋亡素在细胞中的定位与分布。然而实践证明此方 法存在不少缺点, 如需要对细胞进行固定、 染色、 显 色等步骤, 其过程十分繁琐。与此同时, 实验操作使 细胞生长停止, 固定染色使细胞形态发生变化。本 研究构建的凋亡素 ? 增强型绿荧光蛋白载体 ( peg? fp? vp3vp3 ), 可以直接、 方便、 动态地观察转染凋 亡素基因的细胞内凋亡素表达、 定位以及凋亡情况。 报告基因绿荧光蛋白 ( green fluorescent protein , gfp)是从水母 ( jellyfish aequoreavictoria)中分离出 来的一种蛋白质, 其分子量为 27 kda , 在 238个氨基 酸多肽中, 第 7位氨基酸到第 229位氨基酸为荧光 基团所必需, 是一个环状的三肽生色团 2。当能量 从 cat+ 激发的光 (激 )蛋白水母素转换到水母蛋白 时, 可发生强的绿色荧光 3。gfp吸收的光谱, 最 大峰值为 395 nm (紫外 ), 并有一个峰值为 470 nm 的副峰 (蓝光 ); 发射光谱最大峰值为 509 nm (绿 光 ), 并带有峰值为 540 nm的侧峰 ( shouder)。gfp 的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐 ( fi tc)很相似, 因 此为荧光素 f i tc设计的荧光显微镜滤光片组合同 样适用于 gfp观察。尽管 450 490 nm (蓝光 ) 是 gfp的副吸收峰, 但由于长波能量低, 细胞忍受能力 强, 因此更适合于活体检测。由于 gfp荧光是生物 细胞的自主功能, 荧光的产生不需要任何外源反应 底物, 因此 gfp 作为一种广泛应用的活体报告蛋 白, 其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。 研究 4表明, gfp在大肠杆菌和真核细胞中表达时 具有与天然 gfp相同的荧光特性, 并可通过荧光显 微镜直接观察表达结果。 然而在 gfp载体应用于哺乳动物细胞表达时, 细胞培养所需要的温度与 gfp 荧光最强所需温度 不一致, 即一般哺乳动物细胞需要在 37 培养, 而 gfp只有在 30 时发出的绿色荧光最强, 所以在观 察荧光之前需要将培养细胞在 30 放置 4 h以上, 这样会影响细胞培养结果。 cor mack和 pattersom 等 5- 6将 gfp 的第 64位苯丙氨酸突变为亮氨酸 ( phe? 64?1eu), 第 65位的丝氨酸突变为苏氨酸 ( ser? 65? thr), 改善了荧光蛋白的折叠, 提高了溶解度, 突 变后的 egfp比野生型的 gfp荧光强度高 35倍, 并 可在 37 培养时发出强的绿色荧光。现在用于实 验的载体 pegfp? c2中的 egfp基因还经过遗传密 码的优化处理 7, 使其在哺乳动物中的翻译不受影 响, egfp基因上游增加了 kozak共同序列, 使荧光 增强 5 10倍。本研究使用的 egfp比野生型的 gfp荧光强 350倍, 即使有极少量的荧光蛋白表达 就能在荧光显微镜下显示出来, 因而使实验的敏感 性明显增加。张金平等 8在构建的质粒中引入 eg? fp取得了很好的效果。 参考文献: 1 ? danen? van oorschotaa, fischerdf, gri mbergen j m, et a. l ap? optin induces apoptosis in human transfor med and malignant cells but not in nor mal cells . j. proc natla cad sciusa, 1997 ,94 ( 11): 5843?5847 . 2 ? chalfiem, tu丫 euskircheng, wardww,et a. l g reen fluores? cent protein as a marker for gene expression j.science, 1994, 263 : 802?805. 3 ? wardww, cody cw, hartrc ,et a.l spectrophotometric identi? ty of the energy transfer chromo