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基因克隆与表达研究进展 基因克隆与表达研究进展是小柯论文网通过网络搜集，并由本站工作人员整理后发布的，基因克隆与表达研究进展是篇质量较高的学术论文，供本站访问者学习和学术交流参考之用，不可用于其他商业目的，基因克隆与表达研究进展的论文版权归原作者所有，因网络整理，有些文章作者不详，敬请谅解，如需转摘，请注明出处小柯论文网，如果此论文无法满足您的论文要求，您可以申请本站帮您代写论文，以下是正文。 摘要 基因的表达和调控是植物基因工程研究的中心内容之一，从基因克隆方法、克隆载体的构建、瞬时表达分析、报告基因的选择以及基因表达量分析的方法5个方面对植物基因克隆与表达的研究进展进行了综述。关键词 基因表达；基因克隆；表达量分析；northern杂交中图分类号 s785文献标识码a文章编号1007-5739（2008）22-0280-02植物的生长发育和生命周期是不同的基因在时间和空间上有序表达的结果。基因的表达调控受多种内外因子的影响。根据基因表达性质可将其分为2大类：一是瞬时调控或称可逆性调控，包括某种底物或激素水平升降和细胞周期不同阶段中酶活性和浓度的调节；二是发育调控或称不可逆调控，它决定了细胞生长、分化和发育的全部进程。根据基因调控在同一事件中发生的先后次序，又可将其分为转录水平调控、转录后水平调控、翻译水平调控及蛋白质加工水平调控等。植物基因调控主要是在转录水平上进行的，受多种顺式作用元件和反式作用因子的相互协调作用的影响。植物基因启动子是重要的顺式作用元件，是位于结构基因5端上游区的dna序列，能指导全酶与模版的正确结合，活化rna聚合酶，使之具有起始特异性转录的形式，并决定转录的方向和效率以及所使用的rna聚合酶类型，是转录调控的中心。因此，植物基因启动子的克隆，对研究植物基因表达调控和构建表达载体至关重要。1基因克隆方法通过对已发表的大豆基因的克隆方法进行比较分析后发现，其克隆策略可概括为2种：一种是用已知克隆作为探针筛选cdna或gdna文库，从而获得所需的靶基因序列，然后再选择合适的载体进行基因克隆测序。从基因组文库中克隆相对费时，但可获得较多侧翼序列。另一种则是采用pcr技术，即利用基因两端序列高度保守的特点，依据保守区序列设计引物，用pcr直接扩增基因组dna，然后用southern杂交和非整倍体材料进行定位，再亚克隆后测序。2克隆载体的构建植物基因转移的目的在于将目的基因导入需要改良的植物，使之正确而有效地表达，并将产生的目的性状以可预言的方式稳定遗传下去。然而目的基因片段很难直接转入植物细胞，而且由于它自身常无dna复制所需信息，在细胞分裂时不能复制给子细胞，从而丢失，所以人们要把它连在一些能独立于细胞染色体之外复制的dna片段上，这些dna片段就叫载体。常用的载体有质粒和病毒。质粒是最常用的载体，它通常是dna环状分子，可以独立地存在于细菌细胞中，而且质粒上总是有1个或多个可赋予宿主细胞以某些有用特性的基因，如质粒上的抗生素基因可以使宿主细胞在一定浓度的氯霉素或是氨苄青霉素等抗生素存在的培养基中存活。这些抗生素基因在克隆技术中常被用作选择标记（selectable marker），以选择和鉴定重组子。在基因克隆中使用最广泛而且结构最简单的载体一般都来源于较小的细菌质粒，如大肠杆菌中所存在的这种质粒载体，不仅易于纯化，转化效率高，选择重组子方便，而且可携带的外源目的基因的容量也较大（大约5kb）。因此，一些常规克隆实验都用质粒载体。质粒除了在细菌细胞中广泛存在外，其他细胞中并不普遍存在，如在真核细胞中仅发现极少的几种质粒，其中研究最深的是酵母（saccharomyces cerevisiae）中的2um环（2um circle），人们已经将其构建成了能在酵母中表达的载体，使基因工程的应用范围得以扩大。为构建高效植物表达载体，人们需要对天然质粒及病毒进行一系列改造，如加上耐药性基因片段等，以提高基因转化、筛选、表达的效率。构建好载体后，将目的dna片段与载体实现连接，形成全新的重组dna分子，通过一定的方法导入受体植物细胞，便可能获得转基因植株。3报告基因的选择报告基因（reporter gene）是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其他目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：一是已被克隆和全序列已测定；二是表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；三是其表达产物能进行定量测定。在植物基因工程研究领域，已使用的报告基因有以下几种：胭脂碱合成酶基因（nos）、章鱼碱合成酶基因（ocs）、新霉素磷酸转移酶基因（npt）、氯霉素乙酰转移酶基因（cat）、庆大霉素转移酶基因、葡萄糖苷酶基因、荧光酶基因等。nos、ocs这2个基因是致瘤土壤农杆菌（agrobacterium tumfaciens）的ti质粒特有的，对ti质粒进行改造，用相应的致瘤农杆菌转化植物体时，如果外源基因转入植物体中，则这2种报告基因在植物根茎叶中均能表达，不受发育调控，检测时直接用转化体提取液进行纸电泳，染色后在紫外光下观察荧光即可。npt、cat及庆大霉素转移酶基因均为抗生素筛选基因，相关的酶可以对底物进行修饰（磷酸化、乙酰化等），从而使这些抗生素失去对植物生长的抑制作用，使得含有这些抗性基因的转化体能在含这些抗生素的筛选培养基上正常生长，也可以用转化体提取液体、外用同位素标记、放射自显影筛选转化体。目前常用的一种报告基因是-d-葡萄糖苷酶基因，该酶催化底物形成-d-葡萄糖苷酸，它在植物体中几乎无背景，组织化学检测很稳定，可用分光光谱、荧光等进行检测。荧光酶基因（luc）是1985年从北美荧火虫和叩头虫cdna文库中克隆出来的，该酶在有atp、mg2、o2和荧光素存在下发出荧光，这样就可用转基因植物整株或部分直接用x-光片或专门仪器进行检测。4瞬时表达分析瞬时表达（transient expression）是指导入外源基因后在短时间内（数小时至几天）就能检测到其表达产物，但几天后表达水平逐渐降低，直至消失的外源基因表达方式。这种表达方式在启动子研究中得到广泛应用。只要把一定的启动子区域和报告基因构建在一起，转化植物细胞，在短时间内就可以通过测定报告基因的瞬时表达产物分析哪些启动子序列是调节基因表达必需的。5基因表达量分析研究进展现有的基因表达量分析的方法很多，如-actin、荧光定量pcr、半定量rt-pcr、northern杂交、rna酶保护分析等都可以用来做定量分析。这里就试验中常用到的2种方法作一介绍。5.1rt-pcrmrna定量研究一直是分子生物学的重要环节，近年来发展起来的mrna定量研究的方法有nothern-blotting、原位分子杂交、rt-pcr等。传统的nothern-blotting方法定量准确，但其需要较多的rna样品，对于一些难得的材料，很难收集到足够量的标本；对于一些低丰度的基因，用此方法很难检测到；而且此法操作繁琐，周期长。原位杂交可对所要研究的目的基因进行定位和定时研究，但此法操作步骤多，周期长，要想得到理想的结果并非易事。rt-pcr是将目的mrna反转录成cdna，进行pcr扩增反应，即使模板浓度较低，也能检测。刚开始，多采用同位素的方法检测mrna，必须接触同位素，且需经电泳、压片和扫描等多重环节。近来出现的不用溴化乙啶（eb）的荧光定量pcr，但需要特殊的仪器设备，如氦、氖液光引导的专门检测器等（张翔等，1998）。戴建国等利用凝胶成像系统扫描rt-pcr产物荧光强度，建立mrna荧光定量分析方法。 pcr用于检测细胞因子mrna，首先要将mrna 扩增即rt-pcr，又称为细胞因子mrna扩增检测技术，即mapping（massage amplification phenotyping）技术。rt-pc 基因克隆与表达研究进展是小柯论文网通过网络搜集，并由本站工作人员整理后发布的，基因克隆与表达研究进展是篇质量较高的学术论文，供本站访问者学习和学术交流参考之用，不可用于其他商业目的，基因克隆与表达研究进展的论文版权归原作者所有，因网络整理，有些文章作者不详，敬请谅解，如需转摘，请注明出处小柯论文网，如果此论文无法满足您的论文要求，您可以申请本站帮您代写论文，以下是正文。r技术的步骤为：高质量rna的提取：用于rt-pcr的rna分离，通常采用酸化异硫氰酸/酸/氯仿异戊醇直接提取或结合cccl超离心分离（piaa k e et al，1992；larrick j w et al，1989）如果要从总rna中进一步分离poly（a）mrna，可采用oligo（dt）纤维素亲和层析，oligo（dt）25包被的小珠或商品化的poly aaa+rna 分离试剂盒。不管哪种方法必须注意使用rna酶抑制剂并严格操作，防止rna被降解。逆转录过程：逆转录体系包括mrna、dntp、rna抑制剂，转录相物及逆转录酶，根据酶（mmlv或amv）种类不同决定反应温度、ph值和时间。值得指出的是cdna合成后剩余的mrna模板在pcr反应中可能会与cdna发生竞争反应。尽管大多数情况下amv、mm-lv中内在的rna酶h足以降解剩余的mrna，如果逆转录酶缺乏rna酶h活性，则必须加入rna酶h。引物设计及pcr反应。引物设计一般采用已发表的genbank中顺序，引物长度2030bp，扩张长度400bp，pcr扩增后检测之前一般还要确证一下pcr产物是否是预期的结果，采用的方法主要有限制酶图谱，核酸测序或southern杂交。5.2northern杂交（northern blot hybridization）继分析dna的southern杂交方法出现后，1977年alwine等人提出一种与此相类似的、用于分析细胞总rna或含poly a尾的rna样品中特定mrna分子大小和丰度的分子杂交技术，这就是与southern相对应而定名的northern杂交技术。这一技术自出现以来，已得到广泛应用，成为分析mrna最为常用的经典方法。与southern杂交相似，northern杂交也采用琼脂糖凝胶电泳，将分子量大小不同的rna分离开来，随后将其原位转移至固相支持物（如尼龙膜、硝酸纤维膜等）上，再用放射性（或非放射性）标记的dna或rna探针，依据其同源性进行杂交，最后进行放射自显影（或化学显影），以目标rna所在位置表示其分子量的大小，而其显影强度则可提示目标rna在所测样品中的相对含量（即目标rna的丰度）。但与soughern杂交不同的是，总rna不需要进行酶切，即是以各个rna分子的形式存在，可直接应用于电泳。此外，由于碱性溶液可使rna水解，因此不进行碱变性，而是采用甲醛等进行变性电泳。虽然northern也可检测目标mrna分子的大小，但更多的是用于检测目的基因在组织细胞中有无表达及表达的水平如何。6参考文献1 ogawa te，tayama k，kitamur a.genetic improvement of seed storage proteins using three variant alleles of 7s globulin subunit in soybean （glycine max l.）j.japanj. breeding，1989（39）：137-147.2 郭静成，薜彦彬.大豆种子蛋白及氨基酸组分分析j.北京农业大学学报，1985，11（1）：19-29.3 staswick p e，hermodson m a，nielsen n c.identification of the acidic and basic subunit complexes of glycininj.j. biol. chem，1981（256）：8752-8755.4 林忠平.有关提高大豆和其它豆类含硫氨基酸的研究进展j.大豆科学，1985，4（4）：327-335.5王丽侠，郭顺堂，付翠真，等.大豆种子贮藏蛋白11s与7s组份的研究j.中国粮油学报，2004，19（4）：53-57.6 关荣霞，常汝镇，邱丽娟，等.栽培大豆蛋白亚基11s7s组成及过敏蛋白缺失分析j.作物学报，2004，30（11）：1076-1079.7 kitamura k，kaizuma n.mutant strains with low level of 7 sglo-bulin in soybean（glycine max merr.）seedj.japanj. breed，1981，31（4）：353-359.8 takahashi k，banba h，kikychi a，et al.an induced mutant line lacking the -subunit of -conglycinin in soybeanglycine max（l.）merrillj.ikushugaku zasshi，1994，44（11）：65-66.9 samoto m，fukuda y，takahashi k，et al.substantially comp-lete removal of three major allergenic soybean proteins（gly mbd 30k，gly mbd 28k，and the-subunit of-conglycinin）from soy protein by using a mutant soybean，tohoku 124j.biosci biotech biochem，1997， 61（12）：2148-2150.10 odanaka h，kaizuma n.mutants of soybean storage proteins induced with c-ray irradiationj.japan j. breed，1989，39（suppl 1）：430-431.11 hajika m，kitamura k，kitamura k.a line lacking all the seed lipoxygenase isozmes in soybean induced by gamma-ray irraditionj.japanese journal of breeding，1991（41）：507-509.12 harada j j，barker s j，robert b.soybean beta-cong-lycinin genes are clustered in several dna regions and are regulated by transcriptional and posttranscriptional processesj.plant cell，1989（1）：415-425.13 nobuyuki m，motoyadu a，takahashi k.crystal structures of recombinant and native soybean beta-conglycinin homotrimersj.eur j biochem，2001（268）：3595-3604.14 luis p-g，goldberg r b.soybean seed protein genes are regulated spatially during embryogenesisj.plant cell，1989（1）：1095-1109.15 meinke d w，chen j，beachy r n.expression of storage-protein genes during soybean seed developmentj.planta，1981（153）：130-139.其他参考文献baker, sheridan. the practical stylist. 6th ed. new york: harper & row, 1985.flesch, rudolf. the art of plain talk. new york: harper & brothers, 1946.gowers, ernest. the complete plain words. london: penguin books, 1987.snell-hornby, mary. translation studies: an integrated approach. amsterdam: john benjamins, 1987.hu, zhuanglin. 胡壮麟, 语言学教程 m. 北京: 北京大学出版社, 2006.jespersen, otto. the phi