浙江大学生物化学甲实验课件实验9氨基移换反应及其产物的鉴定.pptVIP

实验九 氨基移换反应及其产物的鉴定 丁鸣 一、实验目的和要求 1、学习鉴定氨基移换反应的简便方法及其原理； 2、学习纸层析的原理和操作技术。 二、实验基本原理 1.氨基移换反应： 在氨基移换酶（转氨酶)的催化下，氨基酸的-氨基和-酮酸的-酮基 之间发生的互换反应。 转氨酶的种类很多，任何一种氨基酸进行转氨作用时都由其专一的转氨酶 催化。转氨酶的最适pH接近7.4，在各种转氨酶中，谷丙转氨酶（GPT）和谷草 转氨酶（GOT）的活性最强。 转氨酶广泛存在于机体的各种组织中。在肝、心、肾等组织中谷丙转氨酶 （glutamic pyruvic transaminase, GPT）、谷草转氨酶（glutamic oxalacetic transaminase,GOT）活性较高。 GPT催化下的转氨基反应为： L谷氨酸脱氢酶在体内特别是在肝细胞内含量丰富，活性高，催化L 谷氨酸氧化脱NH2，加碘乙酸能抑制其活性，从而可以保护氨基移换反 应的产物L谷氨酸。 本实验用纸层析法，检查由丙氨酸和酮戊二酸在肝细胞谷丙转氨酶 （GPT) 的作用下所生成的谷氨酸，证明组织内的氨基移换作用。 2. 纸层析原理： 滤纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。利用不同物质在两个互 不相溶的溶剂中分配情况（溶解度）的不同来分离混合物的一种技术。 层析溶剂是由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上羟基具有亲水性，因此吸 附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。进行分离时，由于被 分离物质的组分在两相中的分布不同，随着流动相的移动，物质将在两相间 进行连续的、动态的不断分配，从而造成不同组分移动的速度也不相同。易 溶于流动相中的组分移动快，在固定相中溶解度大的组分移动慢，于是得到 分离。 溶质在滤纸上的移动速率用Rf值表示： 原点 溶剂前沿 样品层析斑点 X Y X原点到层析斑点 中心距离 Y原点到溶剂前沿 的距离 在一定的条件下某种物质的Rf 值是常数。Rf值的大小与样品的性质、结 构、溶剂系统（溶剂的性质、溶剂的pH）、层析的温度和层析滤纸有关。此外 ，样品中的盐分，其他杂质以及点样过多皆会影响样品的有效分离。 用滤纸层析法分离氨基酸，是根据氨基酸样品的R基团的化学结构或极 性大小的不同，将样品氨基酸溶解在适当的溶剂（ 0.01mol/L pH7.4磷酸缓 冲液）中，点样在滤纸的一端，再选用适当的溶剂系统（酚溶液），通过毛 细现象向另一端展层，展层完毕后，用茚三酮作为显色剂，即可得到氨基酸 样品的分离图谱。 3. 茚三酮的显色原理： 氨基酸+茚三酮类 紫红色复合物 80 三、实验材料与试剂 1、实验材料 动物肝脏(牛蛙肝或猪肝） 2、实验试剂 0.01mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）（转氨基反应所需缓冲溶液）； 0.1mol/L丙氨酸（pH7.4）（转氨基反应的底物，纸层析的标准样品）； 0.1mol/L酮戊二酸（pH7.4）（转氨基反应的底物）； 0.1mol/L谷氨酸（pH7.4）（纸层析的标准样品）； 展层溶剂酚溶液：水饱和酚：冰乙酸（300：1）（纸层析用）； 10三氯乙酸（终止酶促反应，使转氨酶及其它蛋白质变性、沉淀）； 0.25%碘乙酸（抑制L谷氨酸脱氢酶活性）； 显色剂（0.1%茚三酮-乙醇溶液）。 四、实验器材与仪器 研钵； 试管及试管架； 恒温水浴箱（37、100）； 铅笔、尺和圆规； 毛细管（直径0.5mm)； 新华定性滤纸（直径11cm）； 剪刀和镊子； 电吹风； 滴管； 康氏皿； 喷雾器； 烘箱（80 ）。 五、实验操作方法和步骤 1、转氨酶液的制备 取新鲜牛蛙肝或猪肝约3g，剪碎用研钵将肝脏碾碎，加3ml磷酸缓冲液迅 速碾磨，加9ml磷酸缓冲液，用两层纱布过滤，收集浆液或滤液即得转氨酶提 取液备用。 2、氨基移换反应 取4支洁净、干燥的试管，按表1操作 管号 试剂、操作 1234 转氨酶提取液 （ml） 1111 0.25%碘乙酸 （ml） 0.50.50.50.5 预温滴加10三氯乙酸溶液2滴， 1005min 置37恒温水浴保温5min 0. 1mol/L 丙氨酸 pH7.4 （ml）111 0. 1mol/L 酮戊二酸 pH7.4（ml）111 0.01mol/L 磷酸缓冲液 pH7.4 （ml）1221 酶促反应混匀，置37恒温水浴保温40min（经常摇动） 终止酶反应滴加10三氯乙酸溶液2滴，置 100恒温水浴保温5min 表1 5.5cm 1cm 用铅笔作出点样位置 用铅笔尖在圆心处截一小孔 3、层析 准备： 取新华定性滤纸（直径11cm）一张，找出圆心，用圆规画一直径2 cm的细 圆圈（保持干净），并按图1用铅笔作出点样位置。找出圆心，用铅笔尖在 圆心处截一小孔（孔径约0.2cm)。 另取2cm3cm滤纸，先将下端剪成须状，卷成“灯芯”，备用。 2cm 3cm 点样：用毛细管依次点标准丙氨酸(Ala)、 谷氨酸(Glu)各点2次 ，其余14号管样液各点23次。点样时，要待前次点样干燥（可用电 吹风吹干）后方可再次点样，点样直径不超过0.3cm。 2 11号管反应样液（ 丙氨酸 ） 22号管反应样液（ 丙氨酸 ） 33号管反应样液 44号管反应样液（ 丙氨酸 、谷氨酸） 5标准样液：丙氨酸 6标准样液：谷氨酸 3 2 4 5 1 6 展层、显色 将下端剪成须状,卷成的“灯芯”，然后将上端插入层析滤纸圆心处的小孔 中, 平放在盛有展层溶剂的康氏皿中,使“灯芯”下端须状浸入展层溶剂中,再 在滤纸上盖上另一康氏皿（图1）。展层剂沿灯心上升到滤纸,再向四周扩散,待 溶剂前沿距康氏皿外槽内缘0.5cm(约需半小时)，取出滤纸，用镊子拔出灯心， 滤纸用电吹风吹干，再用喷雾器向滤纸均匀喷洒0.1%茚三酮乙醇溶液，用电 吹风热风吹干或放入烘箱（80 ）中显色3min。 4 3 2 图1层析装置示意图 1. 康氏皿 2. 展层溶剂 3. “灯芯” 4. 层析滤纸 1 谷氨酸 丙氨酸 丙氨酸 氨基酸样品的分离图谱 溶剂前沿 原点 6 5 1 2 3 4 氨基酸样品的分离图谱 六、结果分析讨论 七、思考题 1.为什么要设计4支反应管？每管所要说明的问题是什么？ 2. 观察