2013两水相系统中蛋白质分配系数的测定.ppt

上上课课课课前：前： vv每每组组组组清洗一个清洗一个50ml50ml容量瓶容量瓶 vv用用蒸蒸馏馏馏馏水水润润润润洗洗后后备备备备用用 vv不用烘干不用烘干 两水相系统中蛋白质两水相系统中蛋白质 分配系数的测定分配系数的测定 指导教师：龚小雁 张秀萍 v了解蛋白质在两水相系统中分配系数的测定方法。 一、实验目的和要求 本实验中： 二、实验原理 两水相系统： PEG/(NH4)2SO4 分配对象：糖化酶 蛋白含量测定方法：考马马斯亮蓝蓝比色法 两水相分配： p在两水相系统中，生物物质与成相组分之间通过疏水键、氢键和离子 键等相互作用而不同程度地分配在两相中。 p分配系数K ： 当萃取达到平衡时，蛋白质在上下两相中的浓度之比，对于固定的相 系统，K为常数。 K = C上/ C下 p相比R ： 上下相体积比。 R = V上/ V下 二、实验原理 二、实验原理 糖化酶： Z生物大分子蛋白，-,-葡萄糖水解酶。 Z黑曲霉经发经发 酵制得 。 Z广泛用于酒、醋、味精等发发酵工业业中起糖化作用，将淀粉 转转化为为葡萄糖 。 考马马斯亮蓝蓝比色法： v常用的蛋白含量检测检测 方法。 v考马马斯亮兰兰G-250是一种染料，酸性溶液中呈棕红红色，与蛋 白质结质结 合后转为转为 蓝蓝色，595nm波长长下有最大吸收值值。低浓浓 度范围围内（0.011.0mg/ml），与蛋白质浓质浓 度的关系服从比 尔定律。 二、实验原理 v试剂试剂 ： PEG400、蒸馏馏水、(NH4)2SO4、糖化酶、考马 斯亮蓝、牛血清蛋白等。 v器材： 移液管、刻度离心管+盖子、台秤、离心机、 试试管、50ml容量瓶、恒温水浴锅锅、分光光度计计+比 色皿等。 三、实验器材与试剂 （一）试剂配制（已配好） 1.考马斯亮蓝G-250溶液：精确称取50mg考马斯亮蓝，溶于10ml 95%乙醇中，并加入50ml 85% 浓磷酸，用H2O稀释定容至500ml 。 2.牛血清蛋白溶液 （BSA）：精确称取0.012g左右的牛血清蛋白， 加入0.105gNaCl,溶于少量蒸馏水中，然后，稀释定容至100ml，配 成 120g/ml的牛血清蛋白原液。 四、操作方法 （二）蛋白质在两相中的分配 10ml刻度 离心试试管 (NH4)2SO4 固体1.30克 PEG400 2.00克糖化酶 2.00ml 水 台秤 总重8.00g 振摇混和 (固体充分溶解 ) 离心 3000转/分 5min 求相比： R =V上/V下 求分配系数 ： K = C上/ C下 四、操作方法 平衡 （三）考马斯亮蓝比色法测定蛋白质含量 1.制作标准曲线：在试管中，按下表精确加样，反应检测。 2.两相中取样及蛋白测定： 上相液：吸取0.5ml，蒸馏水定容至50ml，取1ml稀释液于试管中，按下 表反应检测。 下相液：吸取0.1ml于试管中，加入0.9ml水，按下表反应检测。 标标准曲线线样样品检测检测 BSA/ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 上相稀释释液1.0ml下相稀释释液1.0ml H2O/ml1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 加考马马斯亮兰兰5.00ml，混匀，251保温10分钟钟，冷却 OD/595nm 蛋白量g 空白对照 v绘制标准曲线： v标准曲线方程（线性回归）： 蛋白量：y=ax+b 上相：C上=(ax1+b)*100 ug/ml 下相：C下=(ax2+b)*10 ug/ml 分配系数的计算： OD 蛋 白 含 量 /g 分配系数 K = C上 / C下 操作注意点 p蛋白质分配： 1.称重时，按顺序加入物料，中间不要再去皮，最终控制累积总重8.00g。 2.橡皮塞不干净，用保鲜膜包裹下。 3.离心前试管必须要两两称重平衡。 p取样： 3.不要取相界面附近的样品。 4.取下相样品液时，先用滴管将上相完全吸掉，并吸掉部分下相后，再取样。 5.避免将上相混入下相。 p检测： 6.试管中加完物料后，要混和均匀。 7.保温结束后，立即放入冷水中，待测。 3.分光光度计空白参比管T模式调100%，A 模式调0 。 （一）预习预习 1.配制两水相萃取系统时统时 ，PEG400液体的加量能否改为为量取相应应的体积积？说说明 理由。 2.试试述使用台式离心机的操作顺顺序。 3.用比色法分析上下相蛋白质浓质浓 度时时，如何精确吸出在同一离心试试管中的上下 两相？写出操作步骤骤。 （二）实验结实验结 果和讨论讨论 1.将比色分析的操作过过程及结结果列成表格，作出标标准曲线线，线线性回归归。 2.计计算上下相蛋白质浓质浓 度、分配系数K、相比R，计计算两相中PEG和(NH4)2SO4的 含量。 3.在配制两水相系统时统时 ，为为什么必须须充分混合？混合不充分会带带来什么影响？ 五、思考题 pM：系统组统组 成 pT：平衡时时上相组组成 pB：平衡时时下相组组成 pTMB：系线线 同一条系线线上各点系统统 组组成不同，但平衡后分成