植物组织培养 第七章 植物原生质体培养及细胞融合.ppt

第 七 章 植物原生质体培养及细胞融合 本章内容提要： 原生质体培养的发展与意义 原生质体的分离 原生质体的培养 植物细胞的融合 体细胞杂种鉴定方法 什么是原生质体（Protoplast）？ 1880, Hanstein：质壁 分离时，能够与细胞壁分 开的那部分细胞物质 含义：去掉细胞壁的 由质膜包裹、具有生活力 的裸露细胞。 Protoplast 细 胞 微 丝 叶绿体 线粒体 质 膜 液 泡 细胞核 内质网 微 管 细胞壁 高尔基体 植物细胞模式图 细胞壁主要成分：纤维素25-50%、半纤维素53%和果胶5% 一、发展简史及其意义 1、发展史 v1892年：Klercker机械法(利刃)分离原生质体； v1960年：英国诺丁汉大学Cocking 教授率先利用真菌 纤维素酶，制备了大量具有高度活性可再生的番茄幼 根细胞原生质体； v1968年：纤维素酶和果胶酶投入市场； v1968年：Takebe首先用商品酶进行原生质体分离：烟 草叶肉原生质体，两步法和一步法。 v1971年：Takebe培养烟草叶肉原生质体，首次获 得再生植株。 v1986年：Spangenberg对单个原生质体培养获得 成功。 v1993年：有49个科、146个属的320多种植物，经 原生质体培养得到了再生植株。主要是农作物 和经济植物，如大豆、棉花、油菜、水稻、玉 米、柑桔、苹果、马铃薯、胡萝卜等； 2、原生质体培养的意义 （1）为细胞融合奠定基础 克服有性杂交不能进行细胞质交流的不足。 （2）是遗传工程的理想受体 能够直接摄取外源DNA，细胞器甚至微生物。 Isolated protoplast are capable of ingesting “foreign“ material into the cytoplasm. This material includes the introduction of nuclear, chloroplasts, mitochondria, DNA, plasmids, bacteria and viruses. 原生质体也具有全能性 原生质体是分子水平和细胞水平上研究遗传信息 动态的结合点。 （3）理论研究 细胞壁再生、细胞膜离子转运、病毒侵染。 因为细胞壁不仅具有保护功能，还参与细胞的 生长和分化等生命活动。 必须指出：原生质体必须再生出细胞壁才 能继续发育。 二、原生质体分离 （一） 分离方法 机械法：利刃机械切割 酶解法：果胶酶和纤维素酶处理 1、机械分离（Machanical isolation） Cut plasmolyzed tissue and subsequent deplasmolysis results in expansion and release of the protoplasts from the cut ends of the cell. In practice this technique is difficult and the yield of viable protoplasts is meager. One advantage, however, is that the deleterious effects of the wall-degrading enzymes on the metabolism of the protoplasts are eliminated. 高度液泡化的细胞 2、 酶解分离（Enzymatic isolation） 双子叶 外植体 /培养 细胞 单子叶 植物胚 性细胞 2.1 材料 应选择生长旺盛的植物体幼嫩部分。叶肉细胞 分离原生质体，来源方便，有明显的叶绿体，便于在融合中认 识。 但禾本科叶肉原生质体往往不能分裂,因此常采用悬浮细胞作 为分离原生质体的材料，最适宜的细胞是处于对数生长早期的 细胞。 2.2 酶的种类和浓度 纤维素酶（Cellulase） Onozuka R-10 果胶酶（Pectolyase）Y-23 半纤维素酶（Hemicellulase） 对幼叶来说，酶浓度较低：0.5-1纤维素酶，果胶酶(0.2- 0.5); 酶量少 对愈伤组织、悬浮细胞：纤维素酶、果胶酶的浓度要提高到1 或2。酶量大 酶液PH值：5.4-5.8 因为PH高，酶活性低；PH低，原生质体损坏多 2.3 酶液渗透压 裸露的原生质体必须维持在一定的渗透压下，才既不 涨破，又不因过度收缩而破坏内部结构。因此在酶液中 须加入渗透压稳定剂来代替细胞壁对原生质体起保护作 用。 常用稳定剂是糖醇系统，如：甘露醇、山梨醇、葡萄 糖、蔗糖等。 目前大多数使用甘露醇或山梨醇，它们能稳定地维持 渗透浓度。浓度一般为0.4-0.8 mol/L。而蔗糖等易被 原生质体吸收利用，降低渗透浓度，故不常用。 2.4 材料预处理 (暗处理，预培养和低温处理) 在酶处理前，常把供体组织置于合适浓度的稳压液中 ，使细胞预质壁分离约一小时后再用酶液处理。 原因：预质壁分离可使胞壁内表层充分暴露，增加胞 壁降解酶与胞壁的接触面而提高胞壁降解速度；降低原 生质体内电解质渗漏，防止在分离期间外来酶被吸入细 胞内，降低原生质体对酶液中可能存在的有害影响的敏 感，提高原生质体的稳定性和存活率。 2.6 其它 酶液中加入葡聚糖硫酸钾、CaCl2等盐类 保护细胞膜、提高原生质体稳定性和活力 2.5 酶解处理的条件 光：一般黑暗下静止进行； 温度：25，兼顾原生质体及酶活性； 时间：几小时到几十小时，太长不利于原生质体的活 性，一般24小时。如烟草叶片酶处理2小时后叶肉细 胞解离完毕。 2.7 原生质体分离过程 （一步法以烟草叶片为例） 第一步：预处理即对烟草植株限制供水。 第二步：取幼叶常规表面消毒后在无菌条件下剥去外 表皮切成4cm的小块。 第三步：制作混合酶液（纤维素酶2%和果胶酶0.5 % ）并加入的0.7 mol甘露醇0.1 m mol CaCl2. PH5.6。 第四步：将小块烟叶放入混合酶液25 处理810小时 第五步：过滤、离心、洗涤（ 0.7 mol甘露醇液含0.1 m mol CaCl2 ）。如此23次、得原生质体。 原生质体分离过程（以叶片为例） 过滤、离心 加果胶酶 和纤维素酶 原生质体 叶片 原生质体 愈伤组织 （二） 原生质体纯化 酶处后得到混合液包括： 原生质体、细胞团和组织碎片等，必须将杂质和酶 液除去，才可以继续培养。 原生质体纯化方法： 离心沉淀法 漂浮法 接口法 1、离心沉淀法 原理：应用原生质体的比重大于溶液，离心后原 生质体沉于底部。 步骤： 第一步：原生质体溶液用400目网筛过滤。 第二步：离心（5001000r/min离心56min）。 第三步：吸取上清液，用洗涤液（含甘露醇）重新 悬浮，再离心沉淀。如此23次。 第四步：用原生质体培养液洗1次，收集原生质 体。 洗涤液成分：0.45mol/L甘露醇， 10mmol/LCaCl2 H2O, 0.7mmolK H2PO4, 洗涤液pH： 5.6 2、漂浮法 原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原 生质体漂浮在液体的表面。 洗涤液：3%蔗糖 + 0.4mol/L甘露醇+ 1480mg/LCaCl2 2 H2O 。或11%23%的蔗 糖溶液。 3 、 接口法（以柑桔为例） 25%蔗糖溶液 13%甘露醇溶液 原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液的密度 大于原生质体的密度，另一种溶液的密度小于原生质体的密 度，原生质体介于两种溶液之间。 （三）原生质体活力测定 1、FDA法 2、TTC法 3、酚藏花红染色法 4、形态学观察法 （以上见书 128129页） （四）影响原生质体数量和活力的因素 1、供试材料 2、酶的种类、组合和酶解时间 3、渗透压稳定剂 4、质膜稳定剂 5、pH值 三、原生质体培养 一）培养方法 平板培养、液体浅层培养、固液培养 二）影响原生质体培养的因素 三）原生质体再生 1、平板（固体包埋）培养 原生质体纯化后， 离心，用培养基稀释至 一定密度，再与0.6%琼 脂或低溶点琼脂糖（ 37C左右）混合，培养 于培养皿中。 （一） 培养方法 1.1 饲养层培养 方法一：X-射线杀死原 生质体，与生活力正常的 原生质体混合，加入0.6% 琼脂，制成混合液，培养 于培养皿中。 方法二：X-射线杀死原生质体 ，与0.6%琼脂混合，在培养皿中 铺成平板，作饲养层，再将生活 力正常的原生质体与0.6 % 琼脂 混合，培养于饲养层上。 1.2 共培养法 将生长迅速的原生质体培养物与难于 培养的原生质体混合 前者为后者提供生长因素或成分未知 但能促进生长的扩散型化学物质 2、液体浅层培养 用培养 基离心 用培养 基悬浮 3、 固液共培养 培养皿底部铺一层固体培养基，在其上进行原 生质体浅层培养。 固体培养基中的成分可以向液体培养中释放， 培养物产生的有害物质，也可被固体部分吸收。 固体培养基 （二）影响原生质体培养的因素 1、原生质体的活力 2、起始密度 3、渗透压稳定剂 4、培养基成分 5、培养条件 6、植物材料和基因型 第一次分裂 （三）原生质体再生（Regeneration） 再生细胞壁 荧光增白剂（ 卡氏白) 圆变为 椭圆形 第二次分裂 第N次分裂小细胞团 肉眼可见的细胞团 愈伤组织 肉眼可见细胞团 愈伤组织 愈伤组织 器官发生途径 胚胎发生途径 植株 第三节 原生质体融合 是以原生质体培养技术为基础，借用动物细 胞融合方法发展和完善起来的一门新型生物技术 ，又称体细胞杂交。 不同原生质体之间互相融合，发生胞质基因 重组和/或核基因重组。 技术体系的3个环节： 原生质体融合；选择融合体； 杂种植株的再生和鉴定。 1、原生质体融合意义 克服杂交不亲合 克服生殖器官败育 克服柑桔多胚 2、成 就 q1972年 Carlson 建立第一株烟草体细胞杂种 。 q 1975年柑桔原生质体培养成功； q现有：苹果、猕猴桃、柿、枇杷、马铃薯、番 茄、矮牵牛等作物的原生质体培养成功；木本 植物中柑桔最为成功。 番茄+马铃薯？ 3、融合方法 自发融合 (Spontaneous fusion) 诱发融合 (induced fusion) 物理和化学方法 NaNO3 高pH-高Ca离子 PEG 电场融合 3.1 NaNO3法 1909年：Kuster证实引起亚原生质体融合 1970年：Power报道可重复控制原生质体融合 1972年： Carlson诱导原生质体融合获得首例杂种 植株粉蓝烟草和朗氏烟草体细胞杂种。 NaNO3的作用：中和质膜的负电荷，使原生质体不 再相互排斥，而紧密结合在一起 不足：诱导频率不高。 3.2 高pH - 高Ca 离子法 1973年：Keller和Melchers用pH10.5的 50 mMCaCl2溶液在37时， 诱发烟草叶肉原生质体融合。 优点：杂种产量高。 不足：高pH值对细胞有毒害作用。 3.3 PEG法 PEG：Polyethylene Glycol（聚乙二醇） 1974年：Kao KN和Michayluk采用此法大大 提高融合频率。 1976年：Kao发现用高pH和高Ca结合融合频 率更高。 用高钙强碱溶液代替培养基清洗PEG。 PEG法特点： 融合频率高 可重复性强 植物 + 植物 植物 + 动物 动物 + 酵母 诱发融合无特异性 毒性较低 PEG法 原理： PEG是一种带负电性的高分子化合物，在原 生质体融合中起到一种桥梁作用，可以使原 生质体凝聚； 在洗脱过程中，PEG将被洗掉，导致质膜表 面电荷重排。 粘连的质膜大面积紧密相连，电荷的重排队 导致一个原生质体的负性电荷部位与另一原 生质体的正性电荷部位相连而导致融合。 - +-+- 桥梁 +- PEG被洗掉 +- 电荷重排 +- 原生质体膜接触 +- 融合 示意图 3.4 电融合法 Senda 1979年首先利用此方法实现原生质体融合 电融合仪中有一个融合室，小室两端装有电极，一定密度的原 生质体悬浮液置于其中。在不均匀交变电场的作用下，使原生 质体彼此靠近、接触，排成一条链，再给予一个点脉冲，使原 生质膜发生可逆性电击穿，从而导致融合。 电融合仪 电融合法原理： 交流电场使原生质体表面电荷偶极化，沿 着电极排列，形成串珠。 + - + - + - + - + - + - 负极 正极 + - + - + - + -+ - 施加直流电场后，形成串珠的原生质体在质膜接触处 发生穿孔，开始遗传物质的交流。 + - + - + - + -+ - + - + - + - + - + - + - + - + - + -+ - 原生质体的融合过程包括3个主要阶段： 1)两个或多个原生质体的质膜彼此靠近； 2)局部区域质膜紧密粘连，彼此融合； 3)融合完成，形成球形的异核体或同核体。 原生质体融合后的培养同原生质体培养 供体-受体式细胞融合包括非对称杂交和细胞质杂交 两种方式。 非对称杂交是一亲本的细胞核和细胞质与另一亲本的 少量核物质(12条染色体)和全部细胞质融合； 细胞质杂交是一亲本的细胞核和细胞质及另一亲本的 全部细胞质融合，可能使两种来源不同的核外遗传成 分(细胞器)与一个特定的核基因组结合在一起，这种 杂种叫细胞质杂种。 4、体细胞杂种细胞筛选 1）互补选择法（两次不同培养条件的培养） 第一次培养条件只适合于甲亲本而不适合乙亲本，一段 时间后，生存下来的是：1)未经融合的甲亲本；2)甲甲 融合的产物；3)有甲亲本基因存在的甲乙融合产物。 转入第二个培养条件，只适合乙亲本原生质体生长， 甲原生质体死亡。 两次培养之后，能存活下来的只有具甲乙亲本基因并得 到互补的杂种细胞。 异硫氰酸荧光素（FITC） 异硫氰酸罗丹明（RITC） 分别发出绿色和红色 2）荧光染料法 两个亲本原生质体在融合前用能 发不同颜色荧光的荧光染料进行染色 。细胞分类器辨别和收集发两种荧光 的异核体。 但仪器价格昂贵，不常用。 5、体细胞杂种的鉴定 q 形态学 q 细胞学 q 遗传标记 5-1 形态学 比较再生植株与融合亲本在形态上的异 同：株高、株型、叶片大小、形状、气孔的 大小与多少，花的形状、大小及颜