补肾方药对H2O2诱导损伤的MES23.5细胞HO-1表达研究.doc

补肾方药对h2o2诱导损伤的mes23.5细胞ho-1表达研究 蔡晶 王华金 王婷婷 吴鸿耀 吴芳华 郑毅婷 苏幼燕 （福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州）【摘 要】 补肾中药一贯被认为具有“益肾填精，补骨生髓，健脑益智”的作用，在临床上广泛应用于治疗帕金森病等神经系统疾病。研究表明：在环境和衰老的共同作用下，通过氧化应激、线粒体功能衰竭、细胞凋亡等机制导致黑质多巴胺能（，mes）神经细胞大量变性、丢失，以致pd发病1。其中，氧化应激机制被广泛接受：大量的氧自由基（ros）造成氧化损伤2，与mes神经元凋亡密切相关。同时，研究表明，血红素氧化酶-1(heme oxygenase-1,ho-1)在机体的氧化应激过程中发挥着重要的作用3。故将传统中医理论与现代分子生物学结合，通过体外实验研究具有保护细胞生理功能的补肾中药合理配伍成补肾方药对过氧化氢（h2o2）建立的mes23.5神经细胞氧化应激模型保护作用机理，为补肾方药防治帕金森病提供科学的实验依据。 【关键词】 帕金森病 氧化应激 补肾方药 多巴胺能神经细胞 ho-1表达 1 研究理由及研究意义帕金森病（parkinsons disease，pd）又称“震颤麻痹”，巴金森症或柏金逊症,是中老年人常见的神经系统性疾病，也是中老年人最常见的锥体外系统病。主要病变在黑质和纹状体通路，多巴胺生成减少4-5。帕金森的病理及神经生化的主要改变为黑质和纹状体多巴胺（da）能神经元变性，细胞内嗜酸性路易（lewy）小体形成，以及纹状体da递质量减少。目前引起pd病理改变的确切病因尚不清楚，有遗传学说、病毒学说、变性疾患、老化和环境学说等。许多研究提示可能与线粒体功能障碍、氧化应激、兴奋性神经毒性、神经营养因子缺乏、细胞凋亡等因素有关6。该病属中医学颤症、震颤、振掉等范畴，中医对帕金森病的认识可追溯到黄帝内经。素问至真要大论说：“诸暴强直、皆属于风”，“诸风掉眩，皆属于肝”，“诸痉项强，皆属于湿” 7。补肾中药一贯被认为具有“益肾填精，补骨生髓，健脑益智”的作用，在临床上广泛应用于治疗帕金森病、痴呆、中风后遗症等神经系统疾病。药理研究也证实，以补肾为主的方药可以调节下丘脑神经细胞，改善实验动物神经系统老化，减少血管性痴呆大鼠脑神经细胞凋亡。因此，我们认为补肾方药在多巴胺能神经细胞抗氧化方面可能发挥优势。2 国内外研究现状分析2.1 氧化应激与帕金森病的关系 传统的理论认为，神经细胞损害的分子机制包括：钙超载，大量的钙离子内流；兴奋性氨基酸的大量释放；自由基对神经细胞的直接作用。各方面互相影响。神经细胞损伤后引起细胞的凋亡，凋亡的发生与氧化应激相关，细胞内过高的自由基通过细胞内的信号传导引发细胞凋亡，用自由基清除剂可取得一定的疗效。建立神经细胞损伤的体外模型，是根据上述的原理来进行的8。2.1.1 神经细胞损伤凋亡模型的建立 氧化应激反应的增强是导致多巴胺能神经元凋亡的主要因素之一,大量的氧自由基（ros）造成氧化损伤9。氧化活性物质损伤神经细胞与神经细胞凋亡的发生直接相关，因此，可用此类模型来观察和筛选保护神经细胞的药物。h2o2是自由基的一种成分，同时易放出氧离子形成其它的自由基，故用它建立体外靶细胞的损伤模型及观察药物对自由基的抑制作用。实验药物可用下列3种形式加入：用实验药物处理过靶细胞后，再加入h2o2的培养液；实验药物与含不同浓度的h2o2的培养液同时加入；含不同浓度的h2o2的培养液处理后再加入实验药物。第种方法主要是观察药物对自由基损伤的预防作用，后两种方法是观察实验药物对自由基损伤的修复及治疗作用10。h2o2损伤神经细胞时浓度参数的决定，源于不同组织、不同代数的各种神经细胞对h2o2的敏感性不同，因此，实验造模时各神经细胞所采用的浓度不同，用mtt法来确定h2o2造模时浓度参数，用酶标仪测定od490的值，观察细胞的活性，当od490的值在空白组的50%以内时，为h2o2造模的浓度参数11。 张芳等12采用h2o2作为损伤因素，检测2,3-吲哚醌（isa）对多巴胺能细胞的保护作用及其机制。结果表明isa可减轻h2o2导致的mes23.5细胞损伤，其机制与降低ca2+水平有关。徐胜利等13研究氧化应激诱导多巴胺能神经mes23.5细胞a-突触核蛋白c-末端片段核转位，用200umol/l h2o2处理多巴胺能神经细胞作为氧化应激的细胞模型。采用免疫荧光、硫磺素s组织化学染色和免疫印迹技术检测细胞氧化应激反应中a-突触核蛋白的表达状态和亚细胞定位。结果发现氧化应激可诱导多巴胺能神经细胞a-突触核蛋白c-末端约10kd的片段转位。2.1.2 抗氧化系统在正常的生理状态下，人体代谢产生的自由基可经自由基清除系统灭活。体内的氧自由基清除系统包括两类，即酶和非酶系统。酶主要包括超氧化物歧化酶(sod)、过氧化氢酶(cat)、谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)等。sod为自由基清除的第一道防线，可分别清除超氧阴离子(o2-)及h2o2，因而有效的阻止羟自由基 (oh)形成，防止氧自由基对细胞的损害。cat和gsh-px的主要作用均为催化h2o2还原。谷胱甘肽(gsh)是细胞内的主要抗氧化剂，红细胞内含有高浓度的gsh，几乎占其血浓度的98，gsh与其它巯基化合物还可保持细胞内氧化还原平衡，从而抑制氧化损伤。2.1.3 相关蛋白caspase家族是近年凋亡调控机制研究中的另一个热点。其中caspase-3对神经元的凋亡特别重要。h2o2诱导细胞凋亡的机制可能与caspase-3基因表达有关。曲喜英等14研究表明h2o2可能通过活化nf-kb，进一步活化caspase-3从而诱导mes23.5细胞损伤。 核转录因子-kb(nf-kb)是一种具有多向转录调节作用的蛋白质。其分布广泛，并调节多种基因的转录调控，参与细胞的增生、转化和凋亡等重要的生理病理过程。曲喜英等15研究提示nf-kb可能参与了h2o2诱导细胞凋亡的过程。血红素氧化酶是血红素降解过程中的一种限速酶，以ho-1的研究较多。而ho-1的降解产物中co有重要的抗过氧化特性；同时，在细胞内调节ho-1基因表达的信号通路和基因启动因子均可诱导ho-1基因的抗过氧化应激能力。ho-1降解血红素所产生的co(类似no)已被认为是一种重要的细胞信使，具有多种生理功能。brouard等16研究证实co能明显抑制肝细胞凋亡，加强nf-kb活性，增强ho-1表达，从而保护细胞。2.2 补肾中药对神经系统疾病的保护作用 中医整体调节理论认为“肾藏精，主骨生髓”、“脑为髓之海”。肾之精气的盛衰关系到脑髓的盈亏及大脑功能的正常发挥。故补肾填精益髓是治疗中枢神经系统疾病的一大重要治疗原则。研究发现，神经系统疾病患者脑内抗氧化系统和自由基清除系统功能低下，黑质中cat、gsh-px、sod含量不同程度减少，自由基产生增加，神经元损害加重。陆征宇等17研究补肾养肝熄风方药对帕金森病小鼠纹状体抗氧化酶和细胞凋亡的影响，发现补肾养肝熄风方药可提高纹状体cat、gsh-px、sod水平，减少纹状体神经元凋亡，改善帕金森病症状。本课题组以往研究18从雌激素受体入手，从分子水平研究补肾中药淫羊藿作用于神经系统的可能机制，发现补肾中药可能影响雌激素受体的表达，调节雌激素受体阳性神经元某些关键因子的转录或表达，从而调节神经元道德生长发育、再生，减轻缺血、缺氧及过氧化等各种损失对神经元的破坏。在现代研究中，补肾中药对神经系统的保护作用机理研究较多。2.2.1淫羊藿 淫羊藿延缓衰老的药效成分是淫羊藿多糖（淫羊藿多糖含有甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等单糖残基）19。淫羊藿苷(ica)为其特征成分，目前研究报道其具有雌激素样作用18 、并能改善铝中毒诱导的大鼠学习记忆障碍21等，提示ica可能成为潜在的治疗老年痴呆的候选药物。周氏22研究ica对快速老化小鼠samp8学习记忆功能的影响及与血清雌激素水平相关性发现，ica可以改善samp8的学习记忆能力，其作用机理可能与升高血清雌激素水平有关。2.2.2 肉苁蓉 现代药理研究表明肉苁蓉可抑制单胺氧化酶活性，明显增加多巴胺的含量。王虎等23研究发现肉苁蓉提取物对帕金森病细胞损伤模型有保护作用。tian xf等24研究表明肉苁蓉可以提高多种中枢神经递质的含量，具有很强的抗氧化、抗衰老、抗凋亡的作用。2.2.3 制黄精 滋肾润肺，补脾益气。王玉勤等探讨黄精多糖（psp）对大鼠自由基代谢的影响，提示psp可以提高机体抗氧化能力。2.2.4 当归当归水煎剂有明显的抗氧化作用，对氧自由基有很强的清除作用，对人血sod有非常显著的激活作用,当归水煎剂有明显的抗辐射和化学物质的损伤作用25。当归注射液减弱了缺氧刺激引起的神经干细胞的增殖和分化，当归对一定时限的宫内缺氧新生鼠的神经干细胞的增殖和分化有保护作用26 。kang等27研究发现当归的提取物具有高活性的神经保护作用，通过多种机制对谷氨酸受体引起的神经损伤起到保护作用还能有效的减少过度活化的谷氨酸受体一起ca2+的内流，除此还有效地增加谷胱甘肽量，及细胞看氧化能力和谷胱甘肽过氧化物酶活性，减少氧化应激引起的细胞损伤。2.2.5 丹参服用丹参后对于缺血性中风冠心病、心肌梗死、等患者的体内血液粘稠度有比较显着的下降，因此对有关血液粘稠的患者起到非常明显的改善效果28。丹参中丹参素db-182可提高机体对缺氧的耐受力和改善缺氧后的心肌代谢紊乱29 。2.2.6 黄芪衰老模型小鼠的胸腺组织细胞涂片由于染色固缩，所以hoechest 染色时，细胞核显致密浓染及碎块状致密浓染的情形，而用药（黄芪）组情况有所改善，表明黄芪可改善衰老引起的小鼠胸腺细胞凋亡30。缺氧复氧可赵承血管内皮细胞脂质过氧化损伤，引起内皮细胞的功能异常。黄芪注射液具有抗脂过氧化损伤，维持血管内皮正常的功能31。黄芪加复方丹参注射液显著的改善循环系统，大大降低了缺血性中风死亡率32。黄芪能明显提高脑缺血/再灌注鼠脑组织内sod、一氧化氮合酶（nos）和一氧化氮（no）含量，清除氧自由基，增加微循环灌注，从而有效对抗脑缺血/再灌注损伤33-34。赵燕玲35等研究表明黄芪能减少大鼠脑缺血/再灌注后的神经元凋亡。姚晨玲36等等研究证明黄芪注射液对体外培养的神经细胞去血清损伤有保护作用。3 前景与展望 帕金森病是常见的神经退行性疾病，虽然黑质细胞损伤的原因未明，但是大量研究提示氧化应激是其可能机制。众多研究表明补肾方药通过抗氧化作用来延缓衰老、治疗神经系统疾病。尽管补肾方药在治疗帕金森病的研究近年来取得了一定的成果，但是机理研究还未深入展开。我们将传统中医理论与现代分子生物学水平进行结合，进一步探讨补肾方药治疗神经系统疾病的机理。通过系统的研究，这些问题的解决及其作用机制的阐明，补肾方药对于帕金森病的治疗将会有新的突破。参考文献1 贾建平.神经病学m-6版.北京:人民卫生出版社,2008.6:273-274.2 norris eh，giasson bi，ischiropaulos h，et a1efects of oxidative and nitrative challenges on a-synuclein fibrillogenesis involve distinct mechanisms of protein modificationsjj biol chem，2003，278(29)：27230-272403 徐建平.血红素氧化酶与氧化应激j.中国临床康复,2004,8(28)： 6174-6176.4 李君.中医对衰老的认识j.黑龙江医学，2005，29(10）：788.5 于宝成，王鲁宁.comt抑制治疗帕金森病的新进展j.北京军区医药，2001，13（2）：89-91.6 焦玥，王丹巧,王巍,等.中医治疗帕金森病的研究进展j.中国中医基础医 学杂志，2008，14（11）：875-877. 7 严兴亚，杨文明，黄彩凤，等.帕金森病中医药治疗研究进展j.现代中西医结合杂志，2008，17（15）：2407-2409.8 刘建文.药理实验方法学-新技术与新方法m.北京:化学工业出版 社,2004:240.9 norris eh，giasson bi，ischiropaulos h，et a1efects of oxidative and nitrative challenges on a-synuclein fibrillogenesis involve distinct mechanisms of protein modificationsjj biol chem，2003，278(29)：27230-2724010 刘建文.药理实验方法学新技术与新方法m.北京:化学工业出版 社,2004:92.11 刘建文.药理实验方法学新技术与新方法m.北京:化学工业出版 社,2004:240.12 张芳，董海，岳旺. 2,3-吲哚醌对多巴胺能细胞氧化损伤的保护作用j. 中国药理学通报，2011,27（8）：1081-1085.13 徐胜利，周明，张丽燕等.氧化应激诱导多巴胺能23.5细胞a-突触核蛋白 c-末端片段核转位j.解剖学报，2005,36（4）:337-341.14 曲喜英 张海风 祝其锋.h2o2对pc12 caspase-3和nf-kb p65细胞基因表 达的影响j.武汉大学学报(医学版),2005,26(1):17-20. 15 曲喜英 张海风 祝其锋.h2o2对pc12 caspase-3和nf-kb p65细胞基因表 达的影响j.武汉大学学报(医学版),2005,26(1):17-20. 16 brouard s , otterbein l e, anrather j, et al. carbon monoxide generated by heme oxygenase 1 suppresses endothelial cell apoptosis j .j exp med,2000,192:1015-26.17 陆征宇,赵虹,汪涛，等. 补肾养肝熄风方药对帕金森病小鼠纹状体抗氧化 酶和细胞凋亡的影响j.江西中医药,2011，43(3):85-86.18 蔡晶,杜建,曹治云.补肾中药对雄性大鼠神经系统雌激素受体的影响j. 中国现代医学杂志,2007,17(24):2957-2960.19 洪玉,马惠荣.淫羊藿的药理研究j.陕西中医学院学报,2010，33 （5）:91-92.20 liu j,ye hy. determination of rat urinary metabolites of icariin in vivo and estrogenic of its metabolite on mcf-7 cells j.pharmazie,2005,60:120-125.21 luo y, nie j, gong, qh, et al. protective effects of icariin against learning and memory deficits induced by aluminium in ratsj. clin exp pharmacol physiol,2007,34:792-795.22 周伟勤，邓景岳，毕明刚，等淫羊藿苷改善快速老化小鼠samp8学习记 忆功能及与血清雌激素水平相关性研究j.中国实验方荆学杂志，2009， 15(9)：38-41.23 王虎，李文伟，蔡定芳,等.研究肉苁蓉提取物对帕金森病细胞损伤模型的 保护作用j.中西医结合学报，2007,5(4):407-411.24 tian xf, pu xp.phenylethanoid glycosides from cistanches salsa inhibit apoptosis induced by 1-methyl-4-phenylpyridinium ion in neuron s.j ethnopharmacol. 2005;97(1):59-63.25 刘颖.浅议当归的化学成分与临床药理作用j.中国医药指南,2010, 8（27） ：51-53.26 陈旭东，赵四敏，华新宇，等.当归对宫内缺血新生大鼠神经干细胞增殖、 分化的影响j.中国组织工程研究与临床康复 ,2010,14（27）：5050-5053.27 kang sy, kim yc. decursinol and decursin protect primary cultured rat cortical cells fr