凯氏定氮法在测量大豆蛋白的不确定度分析.docx

河南工业职业技术学院毕业论文题目：凯氏定氮法在测量大豆蛋白的不确定度分析目 录摘 要1 绪 论1.1 本课题的来源、目的及意义1.2 课题背景及国内外研究现状2 凯氏定氮法2.1 概述2.2 凯氏定氮法的特点3 凯氏定氮法测定蛋白质的几个问题3.1凯氏定氮法的原理和过程3.2 凯氏定氮法测定的蛋白质粗蛋白3.3 蒸馏时碱的用量及溶液颜色的变化3.3.1碱的用量3.3.2溶液颜色的变化3.4 硼酸吸收液颜色的变化3.5讨论4 凯氏定氮法中各试剂对消化时间的影响 4.1 概述4.2 仪器与试剂4.3试验方法4.4 结果与讨论5 凯氏定氮法消化装置的改进5.1 概述5.2消化的原装置5.3 改进后的新装置 6 凯氏定氮法测定大豆中粗蛋白不确定分析6.1 原理和方法6.2 不确定度分量及计算6.3 讨论7 凯氏定氮法测定大豆蛋白质的不确定度分析7.1 原理7.2 蛋白质计算数学模型7.3扩展不确定度分析7.4最后结果表示8 凯氏定氮法测定大豆蛋白质含量的方法8.1 概述8.2 试剂与仪器8.3操作方法8.4方法与讨论9 大豆中蛋白质测定应注意的事项探讨9.1 取样9.2 消化9.3蒸馏9.4滴定9.5结果计算10 结束语10.1 本文总结10.2 展望未来致 谢参考文献毕业设计任务书1 绪 论1.1 本课题的来源、目的及意义蛋白质在生物体内占有特殊的地位，它和核酸是构成原生质的主要成分，是生命现象的物质基础。食物中的蛋白质是人体中氮的唯一来源。具有糖类和脂肪不可替代的作用。作为生命的物质基础之一，蛋白质在催化生命体内各种反应进行、调节代谢、抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用。蛋白质的分离与定性、定量分析是生物化学和其他生物学科、食品检验、临床检验、疾病诊断、生物药物分离提纯和质量检验中最重要的工作。蛋白质是由a一氨基酸以酰胺键(肽键)相结合形成的结构极其复杂的高分子化合物，是生物体中的主要含氮物质。蛋白质与细胞结构、酶、激素、病毒、免疫、物质转运和遗传等密切相关，蛋白质测定方法一般可分为间接方法和直接方法。间接方法是通过测定样品中蛋白质的含氮量进行推算蛋白质含量的方法。直接方法则是根据蛋白质的物理和化学性质，直接测定蛋白质含量的方法。蛋白质是生物体中含量最高，功能最重要的生物大分子，与生命的起源和进化都密切相关，因此蛋白质也是生命科学中极为重要的研究对象。关于蛋白质的分析研究，一直是化学家及生物学家极为关注的问题，其含量的测定在生化分析和临床分析中具有重要意义，研究和开发新的、高灵敏度的蛋白质测定方法是生物化学研究的一个活跃领域。测定蛋白质的方法不断发展，主要有凯氏定氮法(国际经典测定方法)、分光光度法、电化学法、滴定法、高压液相色谱法、电泳法、免疫法等。了解各种蛋白质测定方法的原理和技术特点，对在实际工作中选择适宜的分析方法具有重要的指导意义。 1.2 课题背景及国内外研究现状蛋白质是食品检验中经常进行检测的项目。测定食品中蛋白质的含量，了解食品的质量，为合理配膳提供数据，保证不同人群对蛋白质的需要，掌握食品的营养价值和品质的变化，以达到合理利用食品资源。近年来，人们发展了许多测定蛋白质的方法，如双缩脲法、分光光度法、凯氏定氮法、紫外吸收法、染料结合法、质谱分析法等，质谱分析是测定结果最准确的测定方法；凯氏定氮法适用范围最广泛，分光光度法是最为简便快速的测定方法，但就方法的准确性、精密度以及应用程度而言，国际经典测定方法一凯氏定氮法为首选 ，该法也是相关专业学生必须掌握的经典试验方法之一。现在尽管有很多先进的自动或半自动凯氏定氮仪，但这些仪器不仅价格昂贵，且需专门试剂，目前尚难普及，而对大批量的学生试验更不适合，所以凯氏定氮法适用范围是目前分析含氮化合物最常用的方法。2 凯氏定氮法2.1概述将蛋白质样品在硫酸铜的催化下，用氧化性试剂消化分解转化为铵离子，然后将含有铵试液置于蒸馏瓶中，加高浓度碱使铵离子转化为氨，然后与硫酸结合生成硫酸铵，再加热蒸馏，用过是的标准硼酸溶液吸收氨气，再用盐酸标准溶液滴定h2b03，以甲基红作为指示剂，测出含氮量，将结果乘以换算系数，计算出粗蛋白质含量。2.2凯氏定氮法的特点测定蛋白质最常用的方法是凯氏定氮法，它是测定试样中总有机氮最准确和最简单的方法之一，被国际国内作为法定的标准检验方法。该法关键环节有浓硫酸用量、催化剂选择、消化时间、氢氧化钠用量和硼酸吸收液指示剂选择等。样品在消化时加入浓硫酸的量必须过量，一是脱水作用，将样品中有机物脱水然后碳化成c；二是氧化作用，浓硫酸和硫酸钾、硫酸铜一同加热使温度达到400 以上，碳还原硫酸生成so3，而碳本身被氧化成co2；三是分解作用，将蛋白质分解，so2还原n生成nh4 ，本身被氧化成so3；四是吸收作用，生成的nh4 与浓硫酸反应生成(nh4)2so4 ；五是生成的(nh4)2so4保存在浓硫酸溶液中不至于损失 。 样品消化过程要加入催化剂，加入硫酸钾能够提高分解时溶液的温度，使溶液沸点由290提高到400 ，加入硫酸铜、氧化汞和硒粉则能促进试样的分解，缩短消化时间。有试验证明，用硒粉作催化剂可加快消化速率，缩短试样消化时间，其测定结果与硫酸铜作为催化剂的传统方法相当吻合i5，但硒粉使用量过多或与硫酸作用时间过久会使铵态氮成为分子氮而损失i6。虽然加入氧化汞能够节省消化时间，但由于污染较重，多用于仲裁检验i7。目前包括国标方法大多加入硫酸钾和硫酸铜混合催化剂，但众多文献中二者用量的比例有所不同，硫酸钾：硫酸铜比例主要有15：1、10：1、10：09和9：1等，国标方法采用10：1比例，硫酸铜用量是影响消化时间的主要因素l9。样品消化过程中，消化液经过一系列改变最终转变为绿色透明状态，这种过程是碳化的有机物完全被氧化的，但决不表示样品中的氮素全部转变为nh4 。苏军等研究结果表明，消化液澄清后继续消化30 min为宜。蒸馏过程中加入40 氢氧化钠溶液，用于中和样品消化后剩余的浓硫酸，并使(nh4)2so4 转化为nh4 oh，经加热生成nh3逸出，被硼酸吸收。为使样品消化液中的(nh4)2so4 全部转化为nh4oh，40氢氧化钠溶液必须过量加入，用量不够会造成测定结果偏低，用量过多则浪费试剂i4。硼酸吸收液中混合指示剂的组成和配方有数种，如溴甲酚绿一甲基红、甲基红一甲基蓝、甲烯蓝一甲基红等，但以0.5 溴甲酚绿乙醇溶液和0.1 甲基红乙醇溶液混合而成的混合指示剂变色比较敏感。指示剂与硼酸吸收液的比例通常使用1：100或2：1003 凯氏定氮法测定蛋白质的几个问题3.1凯氏定氮法的原理和过程利用硫酸及催化剂与样品加热消化，使蛋白质分解，其中c、h形成co2 和h2o逸出，而蛋白质中的氮则转化成(nh4)2so4，在强碱条件下加热蒸馏，其中nh3被硼酸吸收为(nh4)2b4o7，然后用标准的盐酸溶液滴定，根据盐酸的消耗量和浓度计算出氮的含量，乘以蛋白质系数，即为蛋白质含量。反应式如下：2ch3 ch一c00h+13h2so4= (nh4)2so4+6co2+12soz+16h2o |nh2(nh4)2so4+2naoh=2nh3+nazso4+2h202nh3 +4h3bo3 = (nh4)2b4o7+5h2o (nh4)zb4o7+2hcl+5h2o=2nh4cl+4h3bo3根据原理测定过程可分为消化、蒸馏吸收、滴定三个过程。 3.2凯氏定氮法测定的蛋白质粗蛋白用浓硫酸对大豆进行消化，破坏有机物使含氮物转化成硫酸铵，加入强碱进行蒸馏使氨逸出，用硼酸溶液吸收氨吸收液用盐酸标准溶液滴定，测出氮含量。根据测定原理，在消化过程中除蛋白质中的氮转化成(ni-h)2so4外，样品中非蛋白质中的氮也能转化成(nh4)2sos，计算氮的含量时，认为所有的氮都来源于蛋白质，因此，测定结果比实际值偏高。所以，用凯氏定氮法测定的蛋白质为粗蛋白。3.3蒸馏时碱的用量及溶液的变化3.3.1碱的用量蒸馏时必须加碱(可加入naoh)，加入碱的作用一是中和硫酸，二是使溶液处于强碱性，这样才能使(nh4)2so4变成nh3被蒸馏吸收。那么碱的用量为多少合适呢?碱的用量取决于消化时h2so4的用量和碱的浓度，一般经验认为碱的用量为中和硫酸后再加40。例如：消化时加入浓h2so410ml，naoh的浓渡为40，则naoh的用量为首先计算中和10ml浓h2so4需要40naoh的量：h2so4的摩尔浓渡为184moll，40naoh摩尔浓度为10moll。化学反应式如下：2naoh+h2so4=na2so4+2hzo假如浓硫酸在消化时没有消耗，两者反应时2摩尔naoh和1摩尔h2so4反应，设需要naoh的量为xml，则210x=118410 x=368ml再计算使溶液为强碱性时需要naoh的量:36.840 =1472ml最后计算蒸馏时加入碱的量：368+14.72=5152ml3.3.2溶液颜色的变化消化后溶液的颜色为蓝绿色，这是催化剂中硫酸铜的颜色。当加入氢氧化钠后溶液为浅蓝色，这是硫酸铜与氢氧化钠反应后生成氢氧化铜浅蓝色沉淀的缘故。当加热蒸馏不久，溶液开始变为黑褐色，这是因为在加热条件下氢氧化铜分解生成氧化铜黑褐色沉淀的缘故。反应式如下：2naoh+cuso4=cu(oh)2 +na2so4cu(oh)2=cuo+h2o3.4硼酸吸收液颜色的变化蒸馏吸收时的吸收液为硼酸，浓度为24。硼酸是一种弱酸，ka=581010。蒸馏吸收时所用指示剂是甲基红谟甲酚绿，其变色范围是：ph62 蓝色。正常情况下，当加入该指示剂后硼酸溶液显橙色，蒸馏时氨气被硼酸吸收变成硼酸铵，溶液变成蓝色。但实验中常常会出现加入指示剂后硼酸溶液就变蓝色，是因为配制硼酸溶液时混入碱性物质或蒸馏水偏碱性。测定中应该注意。3.5讨论3.51 凯氏定氮法测定的蛋白质虽然是粗蛋白，但所有样品中蛋白质的测定都采用此法，因此，同样具有真实性和可比性。3.52 蒸馏时碱的用量经计算后准确加人，即会避免因加人量过少影响蒸馏，也会避免因加人量过多而浪费试剂。3.53 硼酸吸收液配制时应用中性蒸馏水，避免碱性物质的混入，盛装硼酸吸收液的容器应刷洗干净。4 凯氏定氮法中各试剂对消化时间的影响4.1概述经典的凯氏定氮法试样消化阶段必须有定氮催化剂与硫酸(比重184，无氮)参与，催化剂一般用cuso5h2o、k2so 。但由于cuso45h o、k2so4 和浓h2so4 的用量不合适，一方面导致消化时间过长，降低了分析化验人员的工作效率，使教学试验不能在规定的时间内完成凯氏定氮的整个过程。另一方面，过量的催化剂与硫酸造成资源浪费及环境污染。在研究经典的凯氏定氮法中，许多人只注重cuso5h o和k2so4用量,而忽略浓硫酸的用量对消化时间的影响。本研究对经典的凯氏定氮法进行了研究，对cuso5h o、k2 s04、和浓h2so4 的用量作l9(3)正交试验，选择出它们的最佳用量，使消化时间大大降低，提高了凯氏定氮的速度。试验证明，该最佳条件对蛋白质含量高的样品还是蛋白质含量低的样品都能完成消化，这对于提高分析化验人员的工作效率和学生教学试验及环境保护都有很大的益处。4.2仪器与试剂(1)仪器。电子天平(ab104-n)；电热恒温鼓风干燥箱(gzx-9030mbe)；控温电炉(北京市永光明医疗仪器厂1000w 220v)；凯氏烧瓶。(2)试剂。cus045h o(分析纯天津市化学试剂一厂)；k2so4 (分析纯莱阳化工实验厂)；h2s04(分析纯莱阳市新兴化工有限公司)。4.3实验方法(1)消化。称取02000 g发酵马铃薯渣(蛋白质含量大于10)置于干燥的100 ml凯氏烧瓶中，加数粒玻璃珠，按表2添加cus045h 0、k2s04、浓h s04，摇匀后，在凯氏烧瓶中加一小漏斗于通风橱内进行消化，先用小火，然后加大火力。(2)方法。以cuso 5h20、k2so4 和浓h2so4 的用量为主要考虑因素，采用l9(3)正交试验，试验设计见表1，试验结果见表2。表1 试验因素水平水平 因素 因素a/kzso4因素b/5水cuso4因素c/hzso413.000.135.0022.500.104.0032.000.053.00表2正交试验结果试验号因素a因素b因素c消化时间/ min13.000.135.0020.0023.000.104.0015.0033.000.053.0026.0042.500.134.0018.6752.500.103.0017.0062.500.055.0018.0072.000.133.0017.3382.000.105.0019.5092.000.054.0018.75r161.0056.0057.50r253.6751.5052.42r355.5862.7560.33r1/320.3318.6719.17r2/317.8917.1717.47r3/318.6720.9220.11优水平azbzczr2.443.752.64优水平组合azbzcz主次顺序bca(3)验证试验。以确定的最佳条件作验证试验，结果所需消化时间仅为12 min。另外，以最佳条件在学生课堂试验中作验证实验，结果与本文的结论完全一致。(4)对比试验。把本次试验确定的最佳条件与其他资料报道的条件作对比试验，对比结果如表3。表3 消化时间对比试验方法试样重/gkzso4/gcuso4.5hzo/g hzso4/g消化时间/min10.200010.000.5020.0030.0020.20003.000.2020.0045.0030.20002.500.136.0025.0040.20002.500.104.0012.004.4结果与讨论(1)由正交试验结果看出，各因素对消化时间的影响是有差异的。各因素的优水平为；cus045hz0 2.50 g，kzso4 0.10 g，浓hzs04 400 ml。以最佳条件作验证试验，消化时间仅为12 min。(2)以消化时间为指标对试验结果进行正交试验极差分析，可知cus045hz0的用量对消化时间的影响为主要因素，浓hzs04和kzs04的用量为第二、第三主要因素。(3)由表3可知，样品用本试验所得结果进行消化，消化时间是方法1 和方法3 的12多，是方法2 的约14。(4)用本文所得出的cus045hz0、kzs04、浓hzs04用量作消化试验，一方面可大大缩短整个凯氏定氮过程的时间，另一方面试剂用量的减少，可降低试验成本，也降低了对环境的污染。这样不仅能使学生课堂试验能在规定的时间内完成，也适合批量样品中蛋白质含量的消化测定，有一定的应用价值。5 凯氏定氮法消化装置的改进1概述凯达尔法，又称凯氏定氮法，用来测定有机物中氮的含量，是一种经典方法。由于该法仪器设备简单，操作方便，又能同时测定多个试样，因而得到广泛应用。凯达尔法配套的仪器为凯氏消化装置、水蒸气蒸馏装置和滴定装置。这些仪器中，水蒸汽蒸馏装置、滴定装置技术较为成熟，而凯氏消化装置仍在不断改进中。普通消化装置必须在通风橱中进行操作，这是因为实验过程中分解产生的soz和so3会造成环