分解尿素的细菌的分离和计数.ppt

一、课题背景一、课题背景 1 1、尿素的利用、尿素的利用 尿素尿素是一种重要的是一种重要的农业氮肥。农业氮肥。尿素尿素不能直接不能直接被农被农 作物作物吸收。吸收。土壤中的细菌将尿素土壤中的细菌将尿素分解成氨分解成氨之后才之后才 能被植物利用。能被植物利用。 2 2、细菌利用尿素的原因、细菌利用尿素的原因 土壤中的细菌分解尿素是因为它们土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶能合成脲酶 CO(NHCO(NH 2 2 ) ) 2 2 脲酶脲酶 + CO+ CO 2 2 NHNH 3 3 + H H2 2 OO 3 3、常见的分解尿素的微生物、常见的分解尿素的微生物 芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、 棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌 也能分解尿素。也能分解尿素。 4 4、课题目的、课题目的 从土壤中分离出能够分解尿素的细菌从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌 一一. .研究思路研究思路 . .筛选菌株筛选菌株 . .统计菌落数目统计菌落数目 . .设置对照设置对照 1 1、实例：、实例： 启示：启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的寻找目的菌种时要根据它对生存环境的 要求，到相应的环境中去寻找。要求，到相应的环境中去寻找。 原因：原因：因为热泉温度因为热泉温度70708080 0 0 C C，淘汰了绝大，淘汰了绝大 多数微生物只有多数微生物只有TaqTaq细菌被筛选出来。细菌被筛选出来。 DNADNA多聚酶链式反应多聚酶链式反应是是 一种在体外将一种在体外将少量少量DNADNA 大量复制大量复制的技术，此项的技术，此项 技术要求使用技术要求使用耐高温（耐高温（ 9393 0 0 C C）的）的TaqDNATaqDNA聚合聚合 酶。酶。 . .筛选菌株筛选菌株 要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包包 括营养、生理、生长条件等；配置合适的培养基括营养、生理、生长条件等；配置合适的培养基 方法：方法： 抑制大多数微生物生长抑制大多数微生物生长 造成有利于该菌生长的环境，造成有利于该菌生长的环境， 结果：结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过稀培养一定时间后，该菌数量上升，再通过稀 释涂布平板法等方法对它进行纯化培养分离。释涂布平板法等方法对它进行纯化培养分离。 2 2、实验室中微生物的筛选原理：、实验室中微生物的筛选原理： 人为提供有利于人为提供有利于目的菌株目的菌株生长的条件生长的条件( (包括营包括营 养、温度、养、温度、pHpH等等) )，同时抑制或阻止其他微生，同时抑制或阻止其他微生 物生长。物生长。 15.0g15.0g琼脂琼脂 1.0g1.0g尿素尿素 10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖 0.2g0.2gMgSOMgSO4 47H 7H 2 2 OO 2.1g2.1gNaHNaH 2 2 POPO 4 4 1.4g1.4gKHKH 2 2 POPO 4 4 3 3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基： 从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上属属 于哪类培养基？于哪类培养基？ 固体培养基固体培养基 在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？ 碳源：碳源：葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素 氮源：氮源：尿素尿素 选择培养基 培养基的培养基的氮源为尿素氮源为尿素，只有能合成，只有能合成脲酶脲酶的微生物的微生物 才能分解尿素，以尿素作为氮源。才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏缺乏脲酶的微脲酶的微 生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发 育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选 择出分解尿素的微生物。择出分解尿素的微生物。 4 4、培养基选择分解尿素的微生物的原理、培养基选择分解尿素的微生物的原理 选择培养基：选择培养基：在微生物学中，将允许在微生物学中，将允许 特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止 其他种类微生物生长的培养基。其他种类微生物生长的培养基。 1 1、显微镜直接计数：、显微镜直接计数： 利用利用血球计数板血球计数板，在显微镜下计算一定容积里，在显微镜下计算一定容积里 样品中微生物的数量。样品中微生物的数量。 . .统计菌落数目：统计菌落数目： 不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数；不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度；需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；有时候个体小的细菌在显微镜下难以观察；有时候 需要染色需要染色 缺点缺点 2.2.间接计数法间接计数法 （1 1）常用方法：）常用方法： 当样品的稀释度足够高时，培养基表 面生长的一个菌落，来源于样品稀释 液中的一个活菌，通过统计平板上的 菌落数，就能推测出样品中大约含有 多少活菌。 （2 2）原理：）原理： 稀释涂布平板法。稀释涂布平板法。 二二. .实验的具体操作实验的具体操作 . .土壤取样土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土 3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信 封中。 取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用 前都要灭菌。 . .制备培养基：制备培养基： 制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。 应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g。 在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行 分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度 原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同 目的：保证获得菌落数在目的：保证获得菌落数在3030300300之间、适于计数之间、适于计数 的平板的平板 三三 样品的稀释样品的稀释 为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？ 原因：原因：土壤中各类微生物的数量（单位：株土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg/kg ）是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中）是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中 ：好氧及兼性厌氧细菌数约为：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 2 185185万，放线菌万，放线菌 数约为数约为477477万，霉菌数约为万，霉菌数约为23.123.1万。万。 结论：结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不为获得不同类型的微生物，就需要按不 同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地 提供选择培养的条件。提供选择培养的条件。 . .取样涂布取样涂布 实验时要 对培养皿作 好标记。注 明培养基类 型、培养时 间、稀释度 、培养物等 。 如果得到了如果得到了2 2个或个或2 2个以上菌落数目在个以上菌落数目在30300 30300的平板的平板 ，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数， 如果如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明 试验不精确试验不精确，需要重新实验。，需要重新实验。 . .微生物的培养与观察微生物的培养与观察 在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔24h24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。 选取菌落数目稳定时的记录作为结果，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止以防止 因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 培养不同微生物往往需要不同培养温度。培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌：细菌：30303737培养培养1 12d2d 放线菌：放线菌：25252828培养培养5 57d7d 霉菌：霉菌：25252828的温度下培养的温度下培养3 34d4d。 每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(CV)M(CV)M 其中，其中，C C代表某一稀释度下平板上生长的平代表某一稀释度下平板上生长的平 均菌落数，均菌落数，V V代表涂布平板时所用的稀释液代表涂布平板时所用的稀释液 的体积的体积(ml)(ml)，M M代表稀释倍数。代表稀释倍数。 注意事项注意事项 为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在3030 300300的平板上进行计数。的平板上进行计数。 为了减少误差可将为了减少误差可将同一稀释度涂布三个或三同一稀释度涂布三个或三 个以上的平皿中个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平，经涂布，培养计算出菌落平 均数。均数。 统计的菌落往往比活菌的实际数目低。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。 涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以 三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌 落数在落数在5050个左右为最好。个左右为最好。 微生物的培养与观察微生物的培养与观察 三三. .结果分析与评价结果分析与评价 1.1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，通过对照实验，若培养物有杂菌污染， 菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则 菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出 分解尿素的微生物。分解尿素的微生物。 2.2.提示：选择每个平板上长有提示：选择每个平板上长有3030030300个个 菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适 。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能 相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确 。 设置对照的主要目的设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素是排除实验组中非测试因素 对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。 . .设置对照：设置对照： 设置对照的方法： 空白对照：不给对照组任何处理因素。 条件对照：给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究的 处理因素。 自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行。 相互对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。 A同学统计的菌落数为150个,而其他 同学统计的结果为50个. A同学的结果与其他同学不同，可能的 解释有哪些呢? 一是由于土样不同； 二是由于培养基污染或操作失误。 小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有 说服力，对照的设置是必不可少的。说服力，对照的设置是必不可少的。 方案一：方案一：由其他同学用与由其他同学用与A A同学相同土样进行实验同学相同土样进行实验 方案二：方案二：将将A A同学配制的培养基在不加土样的情同学配制的培养基在不加土样的情 况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是 否受到污染。否受到污染。 结果预测：结果预测：如果结果与如果结果与A A同学一致，则证明同学一致，则证明A A无误无误 ；如果结果不同，则证明；如果结果不同，则证明A A同学存在操作失误或培同学存在操作失误或培 养基的配制有问题。养基的配制有问题。 大肠杆菌呈黑色大肠杆菌呈黑色 , ,有金属光泽有金属光泽 大肠杆菌在大肠杆菌在伊红美蓝琼脂伊红美蓝琼脂(EMB)(EMB)上典型特征上典型特征 四、鉴别培养基四、鉴别培养基: : 在培养基里加酚红指示剂在培养基里加酚红指示剂, , 若培养基变红若培养基变红, ,可以认为里面有可以认为里面有 分解尿素的细菌分解尿素的细菌 CO(NHCO(NH 2 2 ) ) 2 2 脲酶脲酶 + CO+ CO 2 2 NHNH 3 3 + H H2 2 OO 本课题知识小结本课题知识小结: : 例2在微生物群体生长规律的测定中，种内 斗争最显著最激烈的时期是 A调整期 B对数期 C稳定期 D衰亡期 解析：种内斗争是一种生态因素。种内斗争反应了种内生物 对生存空间和生活资源的争夺。在生活空间充裕，营养充足的时 候，种内斗争的程度是比较低的。随着微生物个体数目的增加， 每个个体的生存空间越来越少，营养物质也越来越少，每个个体 对生存空间和资源的争夺也越来越激烈，种内斗争就越来越激烈 。由此可知，在稳定期的种内斗争最激烈。在衰亡期，微生物的 数目已经开始减少，pH已经极度不适于微生物的生存，次级代谢 产物积累到很高的程度，这时的微生物的生存斗争主要是与无机 环境的斗争。 答案：C 1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（ ） A.在液体培养基上进行 B.至少接种一种细菌 C.接种一个细菌 D.及时补充消耗的营养物质 2.使用选择培养基的目的是（ ） A.培养细菌 B.培养真菌 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别 3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是( ) A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3 C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素 实践训练实践训练 A C D 4.下列说法不正确的是（ ） A.科学家从7080度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚 合酶 B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、 M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值 C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因 素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大， 种类最多。 5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加 入（ ）