《单倍体的产生》PPT课件.ppt

第五章、单倍体的产生 所谓单倍体，指的是具有配子体染色体组成的孢子 体。单倍体在遗传研究和植物育种中的意义在于： 1在单倍体细胞中只有1个染色体组，表现型和 基因型一致，一旦发生突变，无论是显性还是隐性 ，在当代就可表现出来，因此单倍体是体细胞遗传 研究和突变育种的理想材料。 2在品种间杂交育种程序中，通过F1代花药培 养得到单倍体植株后，经染色体加倍立即成为纯合 二倍体，从杂交到获得不分离的杂种后代单株只需 要2个世代，和常规育种方法相比，显著缩短了育 种年限。 一、花药培养的一般程序 n1.取材 花药在接种之前，应预先用醋酸洋红压片法进行 镜检，以确定花粉的发育时期，并找出花粉发育 时期与花蕾或幼穗的大小、颜色等外部特征之间 的对应关系。一般而言，单核后期花药对培养反 应较好，在烟草中，此时花蕾大约与萼片等长， 水稻颖片通常达到最后大小，颜色淡绿，颖内的 花药色亦淡绿。 2 .预处理 适当的预处理可以显著提高花药的愈伤组 织诱导率。常用的预处理方法是低温冷藏 ，具体的处理温度和时间长度因物种而异 ：烟草 79，714 d；水稻710，10 15 d；黑麦l 3，7 14d；大麦 3 7，7 14 d n 3.消毒 花药适宜培养时，花蕾尚未开放，花 药在花被或颖片的严密包被之中，本 身处于无菌状态，因此，通常只要以 70酒精喷洒或擦拭花器或包被着麦 穗的叶鞘表面，即可达到灭菌要求。 4. 接种 n在无菌条件下把雄蕊上的花药轻轻地从花丝上摘 下，水平地放在培养基上进行培养，在整个操作 过程中不应使花药受到损伤，若受损伤，则应淘 汰，因为损伤常常会刺激花药壁形成二倍体愈伤 组织。 n 如果所碰到的是花器很小的植物，如天门冬属 、芸苔属和三叶草属植物等，可能需要借助解剖 镜夹取花药，或是只把花被去掉，把花蕾的其余 部分连同其中原封未动的雄蕊一起接种在培养基 上。 n在有些情况下，甚至是接种整个花序以得 到花粉单倍体。然而这种简单化的方法只 适用于这样一些基因型，即其中雄核发育 在只含无机盐、维生素和糖的简单培养基 上即可进行，而在这种培养基上孢子体组 织增殖的机会很少。 n不过，当必须使用生长素才能诱导花粉粒 雄核发育的时候，应当尽可能把孢子体组 织去掉。 n 由于花药对离体培养的反应存在“密度效 应”，因此每个容器中接种的花药数量不宜 太少，以形成一个合理的群体密度。 5 .培养方式和培养条件 n花药的培养方式主要有3种：一是在琼脂固 化培养基表面培养，二是在加入3 0Ficoll 的液体培养基表面飘浮培养，三是利用固 体一液体双层培养基培养，以便既能保持 较高的接种密度，培养基又不易失水干涸 。 n花药对培养温度的要求因物种而不同，对 于大多数小麦品种来说，在培养的最初6d 给以3032的较高温度，然后再转入28 30下培养，花药出愈率会有明显提高。 水稻花药培养的适宜温度从一开始就是 27。愈伤组织分化阶段对温度的要求不 像诱导阶段那样严格，例如小麦在 17和 30下花粉愈伤组织分化频率没有显著差 异，水稻花粉植株的分化也多在和诱导期 间相同的温度下进行。 n 对光照的要求在物种间差异更为明显，例如连 续光照可显著增加烟草花粉胚的产量，却强烈抑 制曼陀罗的花粉胚胎发生。禾谷类植物在花粉愈 伤组织诱导期间则以暗培养或散射光培养效果较 好，强光会抑制小麦花粉愈伤组织的形成。 n 愈伤组织的分化原则上都应在光照下进行，但 对光照强度和照光时间的要求则因物种而异。例 如水稻花粉愈伤组织在转入分化培养基之初仍不 宜照光培养，须待35 d后再给以每天 14 h1000 n2 000lx的光照，以免引起愈伤组织的老化坏死 。对小麦花粉植株则不宜给以长日照。 6 花粉植株的诱导 n烟草花药接种在无激素培养基上1周以后，即有 部分花粉粒开始膨大，2周以后细胞开始不断分 裂，相继形成球形胚心形胚和鱼雷形胚等，3 周后在花药开裂处即可见到许多淡黄色的胚状体 ，见光后变绿，并逐渐长成小苗。每个花药中长 出的小苗数可从1株到几十株不等，最多者可达 180株以上（图 72） n 禾本科植物的花药在培养中通常不能形成胚状 体，在这类植物中，花粉植株的诱导往往要分两 步进行。首先，第一步，将花药接种在含有 2，4 D（12 mgL）的诱导培养基上，诱导花粉 粒形成单倍体愈伤组织。 n然后，第二步，当花粉愈伤组织形成10 15 d，其直径已长到 1520mm时，及 时把它们转到分化培养基上诱导植株分化 n。分化培养基中不含 2，4D，含有 NAA 和 KT各0.5mgL。在分化培养基上，愈伤 组织表面陆续分化出芽和根（图72） n在烟草中，花粉植株是经由胚状体产生的，因此 几乎都是单倍体。在稻麦等植物中，由于花粉植 株是经由愈伤组织产生的，染色体数常有变化， 其中既有单倍体，也有二倍体、三倍体以及各种 非整倍体等。 7. 壮苗和移栽 n以小麦为例，王培等采用的方法是：将已长 出23片叶的花粉植株转人含有多效唑 3 mg L，NAA和 KT各 05 mgL的LH50mg /L和蔗糖 8的 MS培养基上，于2225下 进行壮苗培养，然后在38低温弱光条件 下越夏，深秋时炼苗移栽。 8.单倍体植株的二倍化 n单倍体植株能正常地生长到开花期，但由于缺少 同源染色体，减数分裂不能正常进行，因而不能 形成有活力的配子。为了得到可育的纯合二倍体 ，必须把单倍体植株的染色体组加倍。虽然在花 粉植株中染色体可自发加倍，但其频率太低。 n通过人工措施则可显著提高加倍频率。诱导染色 体加倍的传统方法是用秋水仙素处理。在烟草中 一般使用0.4的秋水仙素溶液。具体方法是：把 幼小的花粉植株浸于过滤灭菌的秋水仙素溶液中 96 h，然后转移到培养基上使其进一步生长。秋 水仙素处理也可通过羊毛脂进行，即把含有秋水 仙素的羊毛脂涂于上部叶片的腋芽上，然后把主 茎的顶芽去掉，以刺激侧芽长成二倍体的可育枝条 。为了加倍颠茄的单倍体细胞，Rashid和Street （ 19 7 4）在悬浮培养基中加入1g L秋水仙素 ，处理2 4h之后，再把细胞转移到不含这种药物 的培养基中，结果可使70的细胞二倍化。禾本 科植物的染色体加倍，一般都是采用在分蘖盛期 用秋水仙素溶液浸泡分蘖节的办法，例如小麦用 004秋水仙素处理 8 h，水稻，用 02的秋 水仙素处理 24 h。为了增强处理效果，溶液内皆 须加入l2的助渗剂二甲基（DMSO） 。 除了在分蘖盛期加倍之外，也可采用愈伤组织 和试管苗染色体加倍方法，效果很好 9.离体花粉培养 n花药培养器官培养，遗传上的异质性，药壁 细胞有可能脱分化并增殖，所以不是纯粹的单倍 体植株。 n花粉培养可以进行单细胞培养，得到纯粹的 克隆。最早的成功花粉培养是1970年的甘蓝的花 粉悬滴培养法。 10.在高等植物中单倍体的意义 n 由于多数突变是隐性，当同源染色体上有显性等位基 因存在时，它们不能表现，因此在高等植物中突变常常 不易发现。为了使隐性性状表现出来，需要对携有突变 的植株反复自交。然而，某些物种，如茶和黑麦等，是 自交不亲合的，不可能自交。此外，即使在有可能自交 的情况下，4个个体中也只能有1个表现这个隐性性状。 如果发生不止一个隐性突变，要想得到一个能表现所有 突变性状的个体，机会还要少得多。与此相反，在单倍 体中诱发突变很容易表现出来，这是因为单倍体