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组蛋白甲基化在真核基因中的调控作用1 组蛋白修饰的结构基础在真核生物中，核小体是染色质的基本结构单位，是由DNA和组蛋白共同构成。组蛋白分子分为H1、H2A、H2B、H3和H4等5种。核心组蛋白足由H2A、H2B、H3、H4各2个分子形成的八聚体，与其上缠绕的146 bp DNA双螺旋分子构成了核小体的核心颗粒，核小体的核心颗粒之间再由约60个碱基对DNA和组蛋白H1连接起来形成串珠样结构。组蛋白富含带正电荷的精氨酸和赖氨酸，可以与带有负电荷的DNA分子紧密结合。每个核心组蛋白由一个球形结构域和暴露在核小体表面的N端尾区组成，其N端氨基末端会发生多种共价修饰，包括磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化、糖基化、碳基化等。2 组蛋白修饰、组蛋白密码与表观遗传学组蛋白翻译后修饰包括乙酰化与去乙酰化、磷酸化与去磷酸化、甲基化与去甲基化、泛素化与去泛素化等。这些修饰可能通过两种机制影响染色体的结构与功能：改变组蛋白的电荷，因此改变了组蛋白与DNA结合的特性；产生蛋白识别模块的结合表面，因此能募集专一蛋白复合物到它们的表面起作用。单一组蛋白的修饰往往不能独立地发挥作用，一个或多个组蛋白尾部的不同共价修饰依次发挥作用或组合在一起，形成一个修饰的级联，它们通过协同或拮抗来共同发挥作用。这些多样性的修饰以及它们时间和空间上的组合与生物学功能的关系可作为一种重要的表观标志或语言，也被称为“组蛋白密码” (histone code)，在不同环境中可以被一系列特定的蛋白质或者蛋白质复合物所识别，从而将这种密码翻译成一种特定的染色质状态以实现对特定基因的调节。组蛋白修饰与DNA 甲基化、染色体重塑和非编码RNA 调控等，在基因的DNA序列不发生改变时，使基因的表达发生改变，并且这种改变还能通过有丝分裂和减数分裂进行遗传，这种遗传方式是遗传学的一个分支，被称为“表观遗传学”。组蛋白密码扩展了DNA序列自身包含的遗传信息，构成了重要的表观遗传学标志。图1显示的是组蛋白H3 和H4 的N端尾部氨基酸排列顺序、常见的修饰位点及这些位点相应的修饰方式、修饰间相互影响。从图1 可见，组蛋白H3K9 既可被乙酰化又可被甲基化，说明两者间存在竞争性修饰，究竟采取何种修饰视具体情况而异。Litt等研究表明，H3K9 的乙酰化和甲基化间存在负相关，而H3K4 乙酰化与甲基化间存在正相关，由此很容易看出H3K9 和H3K4 的甲基化存在拮抗作用。由此可见，组蛋白修饰以及组蛋白修饰间的调节将是非常复杂的，有待进一步探索。3 组蛋白甲基化和去甲基化3.1 组蛋白甲基化和组蛋白甲基转移酶组蛋白甲基化是表观遗传修饰方式中的一种，参与基因转录调控，通常发生在H3和H4组蛋白N端精氨酸或者赖氨酸残基上的甲基化，由组蛋白甲基转移酶(histone methyltransferases，HMT)催化，该酶分为组蛋白赖氨酸甲基转移酶(HKMT)、组蛋白精氨酸甲基转移酶(HRMT)2个家族。HKMT例如果蝇Su(var)39、Ashl，裂殖酵母Clr4、SET9，酿酒酵母ySETI、set2，粗糙链胞霉菌Dim5，哺乳动物Suv39H1、Suv39H2、G9a、G9a相关蛋白(GLP)、SETBl/ESET、M1。l。、SET7/Set9、NSDl、EZH2等。其甲基化位点多位于H3N端尾区赖氨酸残基上，其中H3K4、H3K36的甲基化可以激活基因转录，而H3K9、H3K27、H3K79、H3K20的甲基化则抑制基因转录。促进基因表达，或是抑制基因表达，除取决于甲基化的位点外，还与甲基化的程度相关，即某一特定残基可以结合不同数目的甲基，赖氨酸残基的单、双、三甲基化(metl、met2、met3)似乎是基因表达调控较为稳定的标记。HRMT如PRMT5、PRMTl、CARMl，其甲基化位点多位于H3 N端尾区精氨酸残基上，能够单、双甲基化。一般来说，精氨酸甲基化与基因激活相关，组蛋白精氨酸甲基转移酶作为协同刺激因子被募集到目标基因的启动子区促进基因表达，若精氨酸的甲基化丢失则与基因沉默相关。3.2 组蛋白去甲基化及组蛋白去甲基化酶多年以来组蛋白甲基化作用被认为是不可逆的，然而有研究显示有一种酶即Jumonji domaincontaining(JmjC)组蛋白去甲基化酶可以催化组蛋白中赖氨酸和精氨酸单、双甲基化的去甲基化，而三甲基化似乎不能被去甲基化。组蛋白去甲基化酶的发现使组蛋白甲基化过程更具动态性，也大大丰富了组蛋白修饰的复杂性。该类酶主要包括肽基精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)和赖氨酸特异性去甲基化酶I(LSDl)等。PAD4是一种可以将甲基化的精氨酸转变为瓜氨酸同时释放甲胺的蛋白，使蛋白质精氨酸甲基转移酶失去作用位点而达到抑制甲基化反应的目的，多作用于H3、H4的多个精氨酸位点，但只对单甲基化有效，对双甲基化无效。LSDl是一种黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依赖的单胺氧化酶，通过氨基氧化作用生成甲醛和去甲基化赖氨酸残基达到去除甲基的目的。该酶可以使得赖氨酸单、双甲基化去甲基，特别作用于H3K4位点，使转录受到抑制。也有报告雄激素受体的作用下，LSDl可作用于H3K9位点，从而激活转录。对于三甲基化似乎无法去甲基化，因此目前暂时认为三甲基化可能是真正永久不可逆的。3.3 SET结构域多数蛋白甲基转移酶都包含有SET结构域，含有SET结构域的蛋白主要功能是调节基因活性，但具体机制还不甚明确。一些植物中含有SET结构域蛋白的相关研究发现这些蛋白控制着组蛋白甲基转移酶类的活性，提示SET结构域可能是甲基转移酶类的重要组成部分。众所周知，核小体组蛋白在异染色体基因沉默中发挥关键作用，已有研究表明很多含有SET结构域的蛋白，如人Suv39H1和裂殖酵母Clr4，都具有组蛋白甲基转移酶活性，并在组蛋白甲基化导致基因沉默担当重要角色。4 组蛋白甲基化对基因表达的调控作用组蛋白甲基化的功能主要体现在异染色质形成、基因印记、X染色体失活和转录调控方面。目前发现24个组蛋白甲基化位点，其中17个位于赖氨酸，其他7个位于精氨酸。赖氨酸可以是单甲基化、双甲基化和三甲基化，精氨酸也可以是单甲基化或者双甲基化。如果把这3种甲基化状态都考虑在内，应该一共有3x1011种组蛋白甲基化组合状态，复杂的组合为组蛋白甲基化发挥功能调控作用提供更大的潜能。4.1 组蛋白甲基化与异染色质形成Suv39hl和suv39h2两种基因编码的甲基转移酶对异染色质的形成起重要作用，若将这两个基因同时突变，细胞中H3K9的甲基化会减少一半，这样出生的小鼠有丝分裂中染色体的分离有缺陷。在裂殖酵母中H3K9位点的甲基化可以将常染色质和异染色质在特定区域分开。在形成异染色质的过程中，Su(var)39与异染色质蛋白1(HPl)之间相互作用控制对方蛋白质的定位。有学者曾针对异染色质的形成提出过一个模型：首先组蛋白脱乙酰酶使H3中的K9、K14脱乙酰化，然后SUV39Hl对H3K9进行甲基化。H3K9的甲基化再影响DNA的甲基化，随后甲基化的H3K9做为一个结合位点招募HPl蛋白的定位，最后HPl定位在间期核的异染色质区，参与染色体高级结构的形成，最终形成异染色质的多聚体。4.2 组蛋白甲基化与基因印记基因印记是指一对等位基因中，一条来自父方，一条来自母方，其中任何一方基因表达处于抑制状态，就称为基因印记。组蛋白甲基转移酶在基因印记中发挥重要作用。缺少组蛋白甲基转移酶会导致基因印记丢失。最近，有两项在大鼠7号染色体中的研究都发现，组蛋白甲基化可能是除了DNA甲基化以外维持基因印记的另一种重要途径。例如，H3K9位点甲基化参与鼠类胚胎Kcnqlotl基因的印记。4.3 组蛋白甲基化与X染色体失活雌性哺乳动物的剂量补偿1是由X染色体失活和Xist非编码RNA(ncRNA)决定的。在胚胎干细胞分化过程中，Xist表达就和H3K27me3、H4K20mel、DNA甲基化有关。胚胎组织随机X染色体失活是由DNA甲基化控制的，而胚外组织对于已经印记的X染色体失活的维持是依赖于Eed的功能和Xist的表达，与DNA甲基化无关。由此可见，X染色体失活和基因组印记可能由同样的机制引起，这些机制中就包括组蛋白甲基化和ncRNA。4.4 组蛋白甲基化与转录调控组蛋白甲基化发生在赖氨酸和精氨酸残基上。研究发现组蛋白赖氨酸甲基化在染色质形成和基因表达过程中起重要作用。最近发现，转录过程中，PAF转录延长复合体可以募集Setl和Set2两种组蛋白甲基转移酶到达mRNA编码区调控基因转录。在这一过程中RNA聚合酶呈现末端磷酸化状态，因此这种磷酸化的RNA聚合酶是组蛋白甲基化和基因转录的联系纽带。4.4.1 精氨酸甲基化精氨酸甲基化发生在组蛋白H3(R2、R17、R26) 和 H4(R3)上，可以是单甲基化或者是双甲基化，后者可以呈现对称双甲基化或者不对称双甲基化。精氨酸甲基化对基因表达起激活作用。组蛋白精氨酸甲基转移酶作为协同激活因子被募集到目标基因的启动子区。这种酶属于组蛋白甲基转移酶中的CARMl和PRMTl家族，这两个家族中的酶分别对H3和H4组蛋白起转甲基作用。4.4.2 赖氨酸甲基化4.4.2.1激活转录功能H3K4和H3K36位点发生的甲基化可以激活基因的转录。H3K4的甲基化必须在H2B的123位赖氨酸呈现泛素化的状态下，但是H3K36甲基化不受这种限制。这主要是因为H2BKl23位泛素化后可以募集H3K4甲基转移酶Setl，而Setl又可以募集PAFl延长复合体，当RNA聚合酶的C端结构域中5位丝氨酸呈现磷酸化状态时，就可以与这种延长复合体一起开启基因转录。甲基转移酶Dotl也可以被募集到该复合体中，从而开启转录。研究还发现，Ubp8作为SAGA复合体中的一个成分，发挥去除泛素化作用，使得H3K4甲基化后出现去泛素化状态，这样就可以募集H3K36甲基转移酶Set2，当H3K36甲基化与RNA聚合酶CTD区2位丝氨酸磷酸化同时发生时，就可以激活基因转录。由此推测H3K4甲基化可能是转录发生的早期事件。上述是在酿酒酵母中做的研究，虽然多细胞动物中也有类似关于H3K4甲基化的报道，但是这种修饰在多细胞动物中是异常复杂的，具体的功能还需要迸一步研究。另一项研究报道Setlp作为H3K4的甲基化转移酶，可以调控酵母中许多基因的表达。lswlp是一种ATP酶，它可以识别H3K4双甲基化和三甲基化的染色体。两者相互联系共同调节特定基因的5端，使RNA聚合酶分布正常，从而促进基因的正常转录。4.4.2.2 抑制转录功能H3K9、H3K27、H3K79、H4K20位点的甲基化发挥转录抑制作用。H3K9甲基化介导基因转录抑制的机制研究较清楚。Suv39是H3K9甲基转移酶，H3K9甲基化后和募集来的HPl蛋白结合。RB蛋白募集Suv39/HPl复合体共同控制cyclinE启动予，从而实现转录抑制功能。研究发现，缺失RB时，H3K9是不甲基化的，而且P1和 cyclinE启动子也是不相关的。所以认为必须要有RB蛋白才能发挥H3K9甲基化的转录抑制功能。值得注意的是，RB蛋白调控的赖氨酸甲基化都发生在该位点去乙酰化后，现在还不清楚是不是RB蛋白本身在募集去乙酰化酶和甲基转移酶过程中本身裁有顺序性。至于HPl是如何介导转录抑制的还不清楚。一种假设认为，HPl蛋白作用于基因启动子区带来多种酶活性，从而介导转录静默。研究发现，HPl可能有ATP酶和去乙酰化酶活性就是这种假设的证据。另外，HPl可以保护H3K9位的甲基化不受去甲基化酶酶攻击，也是维持转录抑制的保证。除了RB蛋白介导组蛋白甲基化的转录抑制作用以外，KAPl和AROS两种蛋白质也可能介导目标基因的转录抑制。以上不同位置的甲基化并不是独立存在的，乙酰化和甲基化也不是没有关系的。学者们认为，存在一种酶学复合体，它同时包括去乙酰化酶和H3K9甲基转移酶。这种多酶体系可以保证乙酰化的激活作用和甲基化的抑制作用，这冲突的两种修饰方式不会同时出现。组蛋白甲基化除了以上三种主要功能之外，还参与DNA的损伤修复过程。H3K79和H4K20甲基化过程如果受阻，就会出现DNA损伤部位周围P53BPl和Crb2的错误定位，从而影响修复过程。表1列出了组蛋白各位点的甲基化转移酶和去甲基化酶及其甲基化位点功能。4.5 组蛋白甲基化与DNA甲基化Tamaru和Selker在链孢霉属中的研究发现，H3K9甲基转移酶dim5被抑制后，DNA的甲基化程度也下调。他们还将脉孢菌株系中H3K9用其他不能发生甲基化的氨基酸代替，发现H3组蛋自甲基化状态改变后hph基因也没有被甲基化，由此而推测组蛋白甲基化可能是DNA甲基化发生的前提。还有研究发现，DNA甲基化起始阶段存在DNA甲基转移酶3(DNMT3)向组蛋白甲基化结合蛋白HPl募集的现象，这同样提示两种甲基化过程可能存在重叠。另外，DNA发生甲基化后会募集甲基结合蛋白，这类蛋白质利用其MBD结构域识别甲基化DNA，从而发挥抑制转录的作用。近来研究发现一种H3K9甲基转移酶结构中也存在MBD结构域。如果此酶的MBD能与甲基化的DNA结合，那么就可以把组蛋自甲基化和DNA甲基化联系起来。4.6 组蛋白甲基化与疾病SET结构域存在于许多与肿瘤发生相关的人类基因之中。过去10年的研究发现，具有此结构域的基因多数都发挥肿瘤抑制的功能。最近发现组蛋白甲基转移酶也具有SET结构域，那么很自然地推测组蛋白甲基转移酶是否也具有肿瘤抑制的功能?RIZl(PRDM2)具有H3K9位甲基转移酶活性。研究发现，在某些肿瘤中，例如：乳腺癌、肝癌、结肠癌、神经母细胞瘤、脊髓瘤、肺癌和骨肿瘤中，该基因发生突变而失去活性，而其失活又引起G2-M期的细胞周期延长，调亡抑制，因此推测H3K9位组蛋白甲基转移酶可能具有肿瘤抑制功能，它的功能缺失可能参与癌症的发生过程。Suv39l/2剔除的鼠基因不稳定，染色体错误分离，替致B细胞淋巴瘤。人的Suv39hl/2与视网膜胶质瘤蛋白(Rb)共同调节周期蛋白E(cycline E)的基因表达，Suv39h1/2的功能下调可能导致增殖失控而发生癌变，如非何杰金氏淋巴瘤。另外，H4R3位的甲基化影响白血病细胞的分化。MLLl甲基转移酶突变与多种类型白血病有关。结直肠癌和肝癌细胞中SMYD3甲基转移酶过表达，前列腺癌、淋巴瘤和乳腺癌中EZH2甲基转移酶高表达，这说明组蛋白甲基转移酶异常可能参与实体肿瘤发生。最近，美国一项临床研究发现，组蛋白甲基化在前列腺癌患者标本中比例很高，估计其他肿瘤中也可能有相似发现。另外，还有报道缺乏甲基的饮食会导致组蛋白甲基化程度低，这类人群发生肿瘤的比例较正常人群高。这也提示组蛋白甲基化可能与肿瘤发生有关。5 组蛋白甲基化及其他化学修饰的共同调控作用组蛋白的不同化学修饰之间相互作用，不仅表现为同种组蛋白不同残基的一种修饰能加速或抑制另一修饰的发生，并且在影响其他组蛋白残基的同时，也受到另外组蛋白残基修饰的调节。另一方面，组蛋白上相同氨基酸残基不同修饰之间也会发生协同或者拮抗。同一组蛋白的不同修饰类型之间发生相互影响称顺式作用，不同组蛋白的修饰之间发生的相互影响称反式作用。不同组蛋白或不同残基修饰之间的调节如图4 所示，组蛋白H3S10 的磷酸化促进H3K9 与H3K14的乙酰化，抑制H3K9的甲基化。H3K14 的乙酰化与H3K4 的甲基化均可进一步抑制H3K9的甲基化，从而导致基因呈活化状态。同时，H3K4 的甲基化还可促进H3K9 的乙酰化。相反，H3K9 的甲基化抑制了H3S10的磷酸化，并且抑制H3K9、H3K14 的乙酰化，从而导致基因沉默。5.1 乙酰化与甲基化组蛋白去乙酰化酶使H3K9、H3K14 去乙酰化，然后SUV39 Hl对H3K9进行甲基化，进而形成异染色质。Aoyama 等报道，在用组蛋白去乙酰化酶抑制剂MS-275 处理120 h 后，组蛋白H3K9 从双甲基化转变成乙酰化。前文提到，一些研究者推测，可能存在一种酶学复合体，它同时包括去乙酰化酶和H3K9 甲基转移酶。这种多酶体系可以保证乙酰化的激活作用和甲基化的抑制作用，使这两种相互冲突的修饰方式不会同时出现。2001 年Bannister 等发现，H3K9 的甲基化是HP1 特异的结合位点，并指出，H3K9既可以发生甲基化，也可发生乙酰化。该位点的竞争性修饰可能提供一个常染色质与异染色质之间的“分子开关”，相关联的各种酶及其活性受其控制，进而精密地调控相对应的复杂的生物学过程。2002 年Daujat 等用雌激素诱导PS2 基因时观察到CBP 和CARM1 之间的协同作用机制。CBP 首先乙酰化K18(接着是K23)，导致CARM1募集到组蛋白H3 尾肽，它刺激H3R17 的甲基化，这个过程与转录活性相关联，因而在体内组蛋白赖氨酸乙酰化和精氨酸甲基化之间存在着相互作用。2003年Ng等的研究显示，H3K79 的甲基化对H4 的去乙酰化非常重要，并且H4K16 的乙酰化对H3K79 的甲基化也非常重要，进而相互拮抗。而2007 年Vermeulen 等的研究表明，H3K9和H3K14 的乙酰化能增强基本转录因子TFIID 与H3K4 三甲基化的结合。其原因可能是这两种蛋白质修饰都与Sir 蛋白质相缔合，而互相竞争。5.2 泛素化与甲基化Sun 等的研究表明，在酵母中泛素结合酶Rad6(Ubc2)通过对组蛋白H2BK123 泛素化这一单向调控途径来介导H3K4 甲基化，但是组蛋白H2BK123 的泛素化并不需要H3K4 的甲基化。Set1介导的H3K4 甲基化需要Rad6催化H2B的123位赖氨酸的泛素化。然而， Set1 基因的剔除并不会影响H2B K123泛素化，这提示二者之间存在一个调控途径: H2B的泛素化在H3K4 甲基化的上游。Ng 等报道H2B K123 和H3K79 在核小体内的空间位置非常靠近，H2B K123 的泛素化对H3K79 的甲基化十分重要，在人类和酵母中，H2B泛素化能分别增强H3K79 的二甲基化和三甲基化。 McGinty 等使用化学方法使H2B 泛素化，直接刺激了hDot1L介导的H3K79甲基化。但反过来H3K79 的甲基化对H2B K123 的泛素化却没有影响，如图6 所示。5.3 磷酸化与甲基化组蛋白H3S