非水介质中酶催化反应类型及其应用.doc

非水介质中酶催化反应类型及其应用摘要：酶催化反应在医药、食品、以及化工领域有着广泛的应用。酶催化反应体系，从水溶液转变到水互溶有机溶剂、水-有机介质两相反应体系、微水有机溶剂、反向胶束体系，该文对近几年来非水介质中酶催化反应研究进展进行了总结，详细地综述了非水体系酶催化反应的类型，提出了应用前景，系统的介绍了固定化酶在非水介质中的催化动力学行为。关键词：非水介质 酶 催化反应 固定化酶1. 非水介质中酶的催化反应及其特征传统的理论认为，生物催化剂，包括酶、细胞均是在水溶液环境下催化水溶性底物的转化。酶作为生物催化剂，在体外只能在水溶液环境才能保持活性，而再有机介质中往往失活或变性。然而事实并非如此，如向酶溶液中加入能与水互溶的酒精等，或制作乳化的水-有机溶剂两相系统，甚至在无水的有机介质中没扔能具有催化活性，证明了在非水有机介质中酶仍能进行催化反应，并且还具有与水溶液系统不同的一些奇异特性。1984年，美国麻省理工学院的科学家Klihanov成功地实现了猪胰脂肪酶在99%的有机溶剂中催化三丁酸甘油酯与醇之间的转酯反应，并证实了酶在100高温下，不仅能够在有机溶质中保持稳定，而且还能显示出很高的的催化没活力。这一发现为酶学研究的应用又带来了一次革命性的飞跃，并成为生物化学和有机合成研究中迅速发展的领域。这个试验为非水相酶学奠定了基础。2. 酶的固定化研究2.1 固定化酶的概论固定化没事20世纪50年代发展起来的一项新技术。所谓固定化酶，即用固体材料将酶束缚或限制与一定区域内，仍能进行其特有的催化反应，并可回收及重复使用的一类技术。2.2 固定化酶的优缺点与游离酶相比，固定化酶有以下优点： 容易将固定化酶和底物、产物分开 可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应 在大多数情况下，能够提高酶的稳定性 酶反应过程能够加以严格控制 产物溶液中没有酶的残留，简化了产物的提取纯化工艺 比游离酶更适于进行多酶反应 可以增加产物的收率，提高产物的质量 酶的使用效率高，成本低同时，固定化酶也存在一些缺点： 固定化时，酶活力有损失 增加了生产的成本，工厂初期投资较大 只能用于可溶性底物，而且适用于小分子底物，对于大分子底物不适合 与完整菌体相比不适于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应 胞内酶经过酶的分离过程2.3 酶的固定化方法酶的固定化方法通常按照用于结合的化学反应的类型进行分类，可分为吸附法、包埋法、共价结合法、交联法4种。2.3.1 吸附法吸附法分为离子吸附法和物理吸附法，是利用离子键、物理吸附等方法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻璃载体上的固定方式。工艺简单及条件温和是其主要特点，吸附工程可同时达到纯化和固定化，酶失活后可重新活化，载体可以再生。2.3.1.1 物理吸附法酶被吸附于不溶性载体上的一种固定方法。物理吸附法具有酶活性中心不易被破坏和酶的高级结构变化少的优点。但他与载体的相互作用力弱，酶易脱落。2.3.1.2 离子吸附法离子吸附法是将酶于含有离子交换基的水不溶性载体相结合的固定方法。离子吸附法操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏，能得到回收率较高的固定化酶。影响酶蛋白在载体上吸附程度的因素： ph值 影响载体和酶的电荷变化，从而影响酶吸附。 离子浓度 多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。 蛋白质浓度 若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度增加，吸附量也增加，直至饱和。 温度 蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。 吸附速率 蛋白质在固体载体上吸附速率要比小分子慢得多。 载体 对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越强。多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面积的大小。2.3.2 包埋法包埋法是用一定的方法将酶包埋在半透性的载体之中，制成固定化酶。此载体的孔径只允许小分子的底物，产物自由穿过，不允许大分子的酶穿过，从而使酶易于与产物分离。优点是酶分子本身不参与水不溶性载体的形成，许多酶都可用这种方法进行固定化。方法较为简单，酶分子仅仅是被包埋起来，而未受到化学反应，所以可以得到活性较高的固定化酶，但是这种方法对于作用于大分子底物的酶是不适用的。同时又与高聚物内的方法对大分子底物产生扩散阻力导致固定化酶动力学行为改变，使活力下降。包埋法主要分为凝胶包埋法和微胶囊包埋法。凝胶包埋法时将个别酶分子包在高聚物格子中。微胶囊包埋法是将酶溶液或悬浮液包在膜内，膜既能使酶存在于类似细胞内的环境，又可以阻止酶脱落。微胶囊固定化酶的制备方法有界面聚合法、液体干燥法、界面沉淀法和脂质体包埋法。微胶囊包埋法有很多优点：微胶囊的大小可以控制；胶囊化时间较短；酶和底物接触表面积很大，利于酶反应；多种酶可以同时包埋在同一胶囊中，利于多酶固定化。2.3.3 共价结合法共价结合法是酶蛋白分子上的官能团和固相支持物表面上的反应基团之间形成化学共价键连接，从而固定酶的方法。因为酶与载体间的连接牢固，不易发生酶的脱落，有良好的稳定性及重复使用性，成为目前研究最为活跃的一类酶固定化方法。其常用的载体包括天然高分子、合成高聚物和无机支持物共价结合法的影响因素： 要求载体亲水，并且有一定的机械强度和稳定性，同时具备在温和条件下与酶结合的功能基团。 偶联反应的反应条件必须在温和PH值、中等离子强度和低温的缓冲溶液中。 所选的偶联反应要尽量考虑对酶的其他功能基团副反应尽可能少。 要考虑到酶固定化后的构型，尽量减少载体的空间为组对酶活力的影响。共价结合法的优点：得到的固定化酶结合牢固、稳定性好、利于连续使用，是目前应用和报道的最多的一类方法。但其缺点也很明显：载体活化的操作复杂，反应条件激烈，会引起酶蛋白高级结构的变化，破坏部分活性中心，因此不能得到活性高的固定化酶。2.3.4 交联法交联法是用多功能试剂进行酶蛋白之间的交联，是酶分子和多功能试剂之间的共价键，得到三向的交联网状结构。共价交联法有4种形式： 酶直接交联法 吸附交联法 酶辅助蛋白交联法 载体交联法2.4 各种固定化酶的特点比较特点吸附法包埋法共价结合法交联法制备易易难难结合力弱强强强酶活力高高中低底物专一性无变化无变化变化变化再生可能不可能不可能不可能固定化费用低中中高3. 在非水介质中酶催化反应的应用非水相酶的典型应用，是酶促氨解反应，酶促氨解反应是20世纪90年代中期发现的一种新型反应，在脂肪酸酰胺的合成、手相药物的拆分中显示出巨大的应用潜力。酶在有机介质中的催化研究为酶工程开辟了一个新的领域，其应用方兴未艾，前途广阔。当周围环境中的水位非极性溶剂所替代时，酶分子内部的输水基团分散，导致三级结构的重排，意味着酶分子构想在极端条件下会发生剧烈的改变。参考文献1. 罗贵民，酶工程 M 北京，化学工业出版社，20022. 郭勇，酶工程 M 北京，轻工业出版社，19943. 袁勤生，现代酶学 M 上海，华东理工大学出版社，20014. 孙君社，酶与酶工程及其应用 M，北京，北京工业出版社，2006欢迎您