番茄叶霉病拮抗菌.doc

吉 林 农 业 大 学学 士 学 位 论 文 题目名称：番茄叶霉病拮抗细菌发酵条件的研究 学生姓名： 潘帅 院 系： 农学院 专业年级： 09级植物保护 指导教师： 马贵龙 职 称： 教授 2013年 5月 20日目 录题目3 摘要及关键词 31 前言 41.1 生物农药的进展 41.2 番茄叶霉病病原菌的生物防治进展 42 材料与方法 52.1 试验材料 52.1.1 供试拮抗菌株 52.1.2 供试病原菌株 52.1.3 供试培养基 52.1.4主要供试器材52.2 试验方法 62.2.1 营养条件对发酵的影响 62.2.2 摇瓶条件优化 72.2.3其他因素对S46发酵液的影响 83 结果与分析 83.1不同碳源对菌株S46产素的影响 83.2不同氮源对S46菌株产素的影响 93.3不同无机盐对发酵液抑菌活性的影响 103.4营养条件正交设计试验 103.5原始发酵培养基配方与最优培养基配方的比较试验结果 113.6摇瓶条件优化 123.7 不同温度对菌株发酵抑菌活性的影响 133.8不同种龄对菌龄对菌株发酵液抑菌活性的影响 13 3.9不同转速对菌株抑菌活性的影响 144讨论 145 参考文献 166 致谢 17番茄叶霉病拮抗细菌发酵条件的研究姓 名：潘帅 专 业：植物保护指导教师：马贵龙摘 要：本试验优化了菌株发酵的培养基配方和发酵条件，提高了菌株产素率。最终培养基确定为：大豆粉15g/L，玉米粉5g/L，蔗糖15g/L，磷酸氢二钾10g/L。优化后的发酵条件为：接种量为3个直径10mm菌碟，发酵时间72h，装瓶量30mL/250L，初始PH7.5，转速200rpm，温度35，发酵时间72 h。关键词：拮抗细菌，发酵条件，理化性质FermentationconditionsoftomatoleafmolddiseaseaderselyaffectbacteriaName：PanshuaiMajor：Plant ProtectionTutor：Ma GuilongAbstract：This experiment had improved fermentation optimization medium fordium and fermentation conditions of s46 strain, and improved its production rate. Finally the culture medium was determined as Soybean meal 15 g/L, corn flour 5 g/L, sucrose 15 g/L, K2HPO4 10 g/L, the fermentation condition was determined as three fungus disc 10mm, , the bottle of 30 mL / 250 L, initial PH 7.5, speed 200 rpm, temperature 35 , fermentation time 72 h.Keywords:Antagonisticbacteria,fermentationconditions,thephysicalandchemicalproperties 1 前 言1.1 生物农药的进展 生物农药又称生物源农药, 是指含非人工合成、具有杀虫、杀菌或抗病能力的生物活性物质或生物制剂, 包括生物杀虫剂、杀菌剂、农用抗生素、生态农药等。在农业生产中，生物农药正在逐渐代替化学农药大面积应用。且随着生物技术的发展，农用抗生素得到了更多的研究和更大的应用。在生物农药的研究与生产中，用于产生农用抗生素的微生物种类主要有真菌、放线菌和细菌。细菌一直是发酵生产中一类重要的微生物。研究证明有许多细菌在作为生防菌株上有潜力。目前发现的可作为生防菌株的细菌常见有以下一些属:芽孢杆菌属(Bacillus)、假单孢菌属(Pseudomonas)、土壤杆菌属(Agrobacetrium)、黄单孢菌属(Xanthomonas)、无定形孢囊菌属(Amorphosporanium) 、节杆菌属(Arthrobacter)、肠杆菌属(Enterbacetr)、欧文氏菌属(Erwinia)、黄杆菌属(Flavobacterium)、哈夫尼菌属(Hafnia)、小单孢菌属(Microminspira)、巴斯德氏杆菌属(Pasteuria)、固氮菌属(Azotobacter)、根瘤菌(Rhizobium)、沙雷氏菌属(Serratia)和产碱菌属(Alcaligenes)。尽管生物农药现在我国已经有了一定的发展，但在其研究、开发和应用等方面仍然存在着许多突出问题，主要体现在尽管生物农药现在我国已经有了一定的发展，但在其研究、开发和应用等方面仍然存在着许多突出问题，发展速度缓慢，推广应用难度大等等。1.2 番茄叶霉病病原菌的生物防治进展对于番茄叶霉病研究的的生防菌，国内刘秋等通过稀释分离法从东北蔬菜保护地的37份土样中分离到了编号为MY02、MY04的两个链霉菌，其菌株的活体及其发酵液对番茄叶霉病原菌表现有强烈的抑菌效果。曹广丽等研究的链霉菌BPsZ发酵液对番茄叶霉病原菌生长也有很好的抑制作用。还有报道顾真荣等，使用枯草芽孢杆菌G3菌剂防治温室番茄叶霉病有良好的效果。随着社会对生物防治越来越重视，许多生物农药已经应用于番茄叶霉病的防治中。陶树春等经室内测试和田间试验，春雷霉素、多抗霉素、武夷菌素、百里香、菇卫士、银果与常用化学农药甲基托布津、代森锰锌一样，对叶霉病病原菌有较强的抑制作用，田间防治效果明显。近年来，植物源农药因其高效、低毒、低残留而越来越受到社会青睐。2002年，孟昭礼等采用室内离体平皿法和田间试验，测定了人工模拟合成的新型植物源农用杀菌剂银泰对番茄叶霉病原菌(Fulviafuzva)生长的抑制和对病害的防效，结果表明20%银泰EC在0-200g/ml浓度范围内，对番茄叶霉病原菌的抑菌作用随浓度的增大而增强;20%银泰 ECl000mg/L防效为84.9%，明显优于对照药剂扑海因。李丽娜等采用生长速率法和悬滴法测定了苦参、牛膝菊、独角莲、蔓陀萝这4种植物的丙酮提取物对番茄叶霉病原菌的生物活性，研究结果表明:质量浓度为0.10g/ml的苦参根提取物对番茄叶霉病原菌的菌丝生长的抑菌率可达到88.57%，对番茄叶霉病原菌的孢子萌发抑制率为100%;独角莲对番茄叶霉病原菌孢子萌发抑制率为99.5%。2 材料与方法2.1 试验材料2.1.1 供试拮抗菌株供试拮抗菌株细菌S46，由本人土壤中分离得到。2.1.2 供试病原菌株番茄叶霉病原菌由吉林农业大学农学院植物病理研究室提供。2.2.3 供试培养基生物测定培养基（PDA）:马铃薯200g，葡萄糖10g，琼脂15g，水1000ml, pH7.0。原始培养基（LB培养基）：蛋白胨10g，NaCl10g，酵母膏5g,水1000ml，ph 7.02.2.4 主要供试器材DZF-6050型真空干燥箱-上海新苗医疗器械制造有限公司高压灭菌锅（CL-32L-日本ALP电器公司超净工作台(MCV-131BNF(T) -日本三洋公司光照培养箱 (MLR-350HT) -日本三洋公司智能霉菌培养箱（MJX）-宁波江南仪器厂恒温振荡培养箱(HZQX100) -太仓市试验设备厂高速冷冻离心机-德国KONTRON公司微量移液器-上海华运分析仪器有限公司酸度计（PHS-3C）-上海精密科学仪器有限公司电子天平-北京赛多利斯天平有限公司QL-866涡旋器-麒麟医用仪器厂79-2双单磁力搅拌器-金坛市科析仪器有限公司试验室专用超纯水仪-沃特福股份有限公司-80低温保存箱-SANYO电器.GG-17抽滤瓶500mL -上海肯强仪器有限公司2.2 试验方法LB培养基是细菌培养中最常见的培养基，因此，本试验以LB培养基为原始培养基进行优化。2.2.1 营养条件对发酵的影响 番茄叶霉拮抗细菌的发酵试验需要在配制的培养基中进行 从而培养基的营养成分 例如碳源 氮源 无机盐以及培养基的优化对发酵和拮抗细菌产量会产生影响2.2.1.1 不同碳源对发酵液抑菌活性的影响将LB培养基培养基中的酵母膏分别用蔗糖、葡萄糖、玉米粉、淀粉、麦芽糖、甘油等量替换，其他成分不变，分别配置成6种不同的培养基，37C 下200rpm震荡培养48h后，用抑菌圈法测定抑菌活性。每种培养基做三次重复。2.2.1.2 不同氮源对发酵液抑菌活性的影响将LB培养基中的蛋白胨以大豆粉、蛋白胨、硝酸铵、氯化铵、硝酸钠等量替换，其它成分不变，分别配置成5种不同的发酵培养基，37C下 200rpm振荡培养48h后，用抑制圈法测定抑菌活性。每种培养基做三次重复。2.2.1.3 不同无机盐对发酵液抑菌活性的影响将牛LB培养基中的蛋白胨去掉用磷酸氢二钾、氯化钠、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、硫酸亚铁、硫酸锌等量替换，其它成分不变，分别配置成7种不同的发酵培养基，37C 下200rpm振荡培养48h后，抑制圈法测抑菌活性。每种培养基做三次重复。2.2.1.4 营养条件正交试验根据以上试验确定最佳的碳源、氮源和无机盐后，选取最佳因素进行正交设计试验，将各因素按照表2-1中碳源、氮源和无机盐的组合配置不同的培养基，进行摇瓶发酵试验。发酵试验重复三次，将三次的平均值作为试验结果，确定碳、氮源和无机盐的最佳组合。表2-1正交试验因素水平的选取Table 1-1 Scheme of orthogonal水平因素(g/L)豆饼粉（A）玉米粉（B）蔗糖（C）磷酸氢二钾（D）155552101010103151515152.2.1.5 LB培养基和优化培养基的结果比较接种相同浓度的S46菌到相同条件的LB培养基和优化后的发酵培养基中，其他培养条件均一至。48h后，分别测定其发酵液对番茄叶霉病的拮抗效果，重复三次试验。2.2.2 摇瓶条件优化在确定发酵培养基成分后,利用L9（34）正交试验法，按照表2-2所选因素及水平，对装液量、发酵时间、接种量、初始pH值这4种因素进行发酵条件的优化选择，结果用抑制圈法测抑菌活性，三次重复试验。表2-2正交试验因素水平的选取Table 1-2 Scheme of orthogonal水平因素A:装量(mL/250mL)B:发酵时间(h)C:接种量(10mm菌碟)D:初始pH值1302416.524048273507237.52.2.3 其他因素对S46发酵液的影响除了营养物质对番茄叶霉拮抗细菌发酵会产生影响以外，其他的物理或者化学因素如培养基温度 种龄 转速等也会对发酵产量产生影响。2.2.3.1 培养温度对发酵液抑菌活性的影响在其他培养条件一致的条件下，将培养基分别在26、28、30、32、34C恒温摇床培养后，用抑菌圈法分别测定发酵液的抑菌活性。2.2.3.2 种龄试验同LB培养基做种子培养液，用直径10mm的S46菌碟分别接入6个种子培养基中，于37、200rp/m条件下分别培养16h、22h、28h、34h、40h和46h后，以6%(v/v)的接种量将种子液分别接种在优化后的发酵培养基中，分别发酵培养60h后，用抑菌圈法测定发酵液的抑菌活性。2.2.3.3 转速对发酵液抑菌活性的影响在其他培养条件一致的条件下，将培养基分别在120、150、180、210r/mim摇床培养后，用抑菌圈法测定发酵液的抑菌活性。3 结果与分析3.1 不同碳源对菌株S46产素的影响试验以番茄叶霉病原菌为指示菌，发现以葡萄糖、玉米粉、蔗糖、麦芽糖、甘油，麦芽糖作为碳源进行发酵，S46的发酵液都能不同程度产生抑菌效果，用这六种成分为碳源时，结果如表3-1所示。结果表明：抑菌圈直径从高到低依次为蔗糖葡萄糖玉米粉淀粉麦芽糖甘油，其中以蔗糖为碳源时，菌株S46抑菌能力最强。最大抑菌直径可达26mm。其中葡萄糖和玉米粉的抑菌圈也较大，分别可达25mm和23mm。表3-1 不同碳源对菌株S46产素的影响Table 3-1 Effect of different carbon sources on fermentation bioactivity of S46不同碳源Carbon sources抑菌圈(mm)Inhibition zoneI平均值Average玉米粉 Corn meal22.023.024.523.2葡萄糖 Glucose23.527.025.025.2蔗糖 Sucrose24.529.025.026.2淀粉 Starch18.016.519.017.8麦芽糖 Maltose15.519.022.018.8甘油 Glycerol15.020.018.017.73.2 不同氮源对S46菌株产素的影响试验以番茄叶霉菌为指示菌，用大豆粉、蛋白胨、硝酸铵、氯化铵、硝酸钠等量替换LB养基中的蛋白胨，对S46进行摇床发酵培养，结果如表3-2所示。结果表明：抑菌圈直径从高到低依次为大豆粉蛋白胨硝酸铵氯化铵硝酸钠。其中以大豆粉为氮源时抑菌能力最强。表3-2 不同氮源对菌株S46产素的影响Table 3-2 Effect of different nitrogen sources on fermentation bioactivity of S46不同氮源Nitrogen sources抑菌圈(mm)Inhibition zone平均值Average蛋白胨peptone27282827.7硝酸钠 NaNO320161717.7硝酸铵NH4NO325252324.3氯化铵NH4Cl22191920.0大豆粉Soybean flour28292828.33.3 不同无机盐对发酵液抑菌活性的影响将LB培养基中的蛋白胨去掉，以磷酸氢二钾、氯化钠、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、硫酸亚铁、硫酸锌等量替换，结果如表3-3所示。结果表明：抑菌圈直径从高到低依次为磷酸氢二钾 氯化钠 氯化钾 硫酸镁 氯化钙 硫酸亚铁 硫酸锌。 表3-3 不同无机盐对菌株S46产素的影响Table 3-3 The influence on S46 strain under different inorganic salts不同无机盐抑菌圈(mm)Inhibition zone平均值Average氯化钠NaCl232324.525.5氯化钾KCl222322.522.5磷酸氢二K2HPO428252726.7硫酸亚铁FeSO41817.51817.8氯化钙CaCl219191818.7硫酸镁MgSO41919.518.519硫酸锌ZnSO415.5151515.23.4 营养条件正交设计试验由以上结果可知，最佳碳源是蔗糖，最佳氮源是大豆粉，最佳无机盐是磷酸氢二钾。碳源是发酵培养液的主要原料之一，是供给菌种生命活动所需能量和构成菌体细胞及合成抗生素的主要物质来源。因此，碳源的不同，可以在很大程度上影响抗生素发酵的产量。根据菌株对碳源的利用情况，碳源又可分为速效碳源（如糖类）和缓慢利用碳源（如玉米粉）两类。速效碳源利用较快，但缓慢利用碳源较速效碳源更便宜、易得，因此，在培养基中往往将速效碳源慢利用碳源混合使用，这样可以节约成本。因此，本试验选择了蔗糖和玉米粉共同做碳源。按照表2-1正交试验因素水平的选取进行的营养条件正交设计试验，结果如表3-4：表3-4营养条件正交设计试验结果Table 3-4 The test results of nutritional conditions by orthogonal design试验号ABCD抑菌圈（mm）111112452122234.03133325.04212319.05223124.06231222.57313234.58321320.59332134.0K18357867.582.5K265.57858791K38981.583.564.5k127.82622.527.5k221.826.22930.3k329.727.227.821.5R7.91.26.58.8根据上表R值可知：对菌株S46发酵培养基营养条件的影响因素的大小顺序为DACB，磷酸氢二钾豆饼粉蔗糖玉米粉。试验号2.7.9均有较好效果，其中7最好，即豆饼粉15g/L，玉米粉5g/L，蔗糖15g/L，磷酸氢二钾10g/L。3.5 原始发酵培养基配方与最优培养基配方的比较试验结果以番茄叶霉病菌为指示菌，用通过以上试验得到的最优培养基配方与原始培养基配方做发酵培养基分别进行摇瓶发酵试验，结果见下表3-5。结果表明，抑菌直径较原始发酵培养基的抑菌直径提高了28.5%。表3-5 优化培养基与原始培养基发酵结果的比较Table 3-5 Comparison of optimal medium and original medium病原菌Pathogen抑菌圈直径（mm）Inhibition提高百分率（%）Percentage of enhacement原始培养基Original medium优化培养基Optimal medium番茄叶霉28.036. 028. 5%3.6 摇瓶条件优化按照表2-2正交试验因素水平的选取进行的营养条件正交设计试验，结果如表3-6。表3-6 摇瓶条件正交设计试验结果Table 3-6 The test results of shake flask by orthogonal design试验号A:装量B:发酵时间C:接种量D:初始pH值抑菌圈(mm)1111117212223331333354212323522312162312267313220.58321322.59332129K18560.541.567K27076.58579.5K3729083.580.5k128.320.217,526.5k223.3303230.3k32427.224,526.8R59.714.523.8根据上表R值可知：菌株S46发酵摇瓶条件的的影响因素大小顺序为DCBA，试验号2.3.9均有较好效果，3最好,即接种量为3个直径10mm菌碟，发酵时间72好，装瓶量30mL/250L，初始PH7.5。3.7 不同温度对菌株发酵抑菌活性的影响不同温度对菌株发酵抑菌活性的影响结果如表3-7所示。结果表明S46发酵的最适宜温度为35。表3-7 不同温度对菌株发酵抑菌活性的影响结果Table 3-7 Effect of different Temperature on fermentation bioactivity温度（）抑菌圈（mm）Inhibition zone平均值2526.524.025.025.23030.028.528.028.83535.034.536.535.34034.535.534.034.74530.029.530.029.83.8 不同种龄对菌龄对菌株发酵液抑菌活性的影响不同种龄对菌龄对菌株发酵液抑菌活性的影响结果如表3-8所示。结果表明S46发酵的最佳接种种龄为24h。表3-8 不同种龄对菌龄对菌株发酵液抑菌活性的影响结果Table 3-8 Effect of different seed ages on fermentation bioactivity种龄抑菌圈（mm）Inhibition zone（mm）123平均122433333024363636363633363434.34832343433.33.9 不同转速对菌株抑菌活性的影响不同转速对菌株抑菌活性的影响结果如表3-9所示。结果表明S46发酵的最佳转速为200 rpm。表3-9 不同转速对菌株抑菌活性的影响结果Table 3-9 Effect of different Rotatory velocity on fermentation bioactivity摇床转速（rpm）Rotatory velocity抑菌圈（mm）Inhibition zone平均值Average16030.529.031.030.117033.534.032.033.118033.536.034.534.719035.036.534.535.320035.038.036.536.521035.536.034.535.322034.033.530.532.74 讨论在对菌株S46发酵条件优化的试验中，首先确定最优碳源为玉米粉和蔗糖的符合使用，最优氮源为大豆粉，然后通过正交试验得到各营养因子的最佳组合：豆饼粉15g/L，玉米粉5g/L，蔗糖15g/L，磷酸氢二钾10g/L。之后，通过单因子试验和正交试验得到最优发酵条件：接种量为3个直径10mm菌碟，发酵时间72好，装瓶量30mL/250L，初始PH7.5，转速200rpm，温度35。在最优发酵条件下，发酵时间设为72h时，S46菌株产素量最大。本试验通过菌株S46分离得到接抗细菌而进行番茄叶霉拮抗细菌的发酵条件研究，分别在不同碳源，氮源，无机盐等营养条件方面试验，得出番茄叶霉拮抗细菌的最适营养发酵条件。其次通过药瓶条件优化调节抑菌圈活性，最后分别在不同温度 种龄 转速等其他方面对菌株发酵液抑菌活性进行试验得出最适发酵条件，最终提高拮抗细菌的发酵产量。本实验对番茄叶霉拮抗细菌发酵条件的研究在实验室基础上进行，只进行了粗略笼统的研究，部分实验数据只能初步进行确定，具准确的结果还有待进一步研究。由于LB培养基是细菌培养中最常见的培养基，其营养成分组成比较简单，因此本试验优化出的培养基的营养成分组成也比较简单，若要得到效果更好的培养基可选择营养成分组成更为全面的培养基为原始培养基或增加培养基的营养成分组成进行优化。本试验采用S46菌株作为供试菌株材料。拮抗菌株的分离、纯化和筛选是本试验的基础部分，工作量较大，耗时长，所以也会产生一些实验误差，本次试验还需进一步严禁操作。参考文献1. 严占勇, 张定贵, 易龙. 微生物农药在烟草生产上的应用现状分析与建议 J. 植物保护, 2009, 36( 4): 24- 282.孙杨.茄叶霉病拮抗细菌的筛选、鉴定及其活性物质的研究硕士论文.吉林农业大学，2012.3.孟昭礼，罗兰.人工模拟的植物源杀菌剂银泰防治番茄3种病害效果研究I.中国农业科学，2002，35(7):863一866.4.朱昌雄 .我国农用抗生素的研