《桑叶多酚氧化酶》word版.doc

I 1 第一章 桑叶多酚氧化酶的研究意义 1.1 桑叶及多酚氧化酶的简介 1.1.1 桑叶的简介 桑叶是桑科植物桑的干燥叶，又名家桑、荆桑、桑椹树、黄桑等，全 国大部分地区多有生产，具有降血压、血脂、抗炎等作用。由中国少数民 族苗族所传秘方，原料来源于云贵高原无污染地带的稀有植物，是一款具 有较强抗氧化功效的袋茶饮。富含稀有元素有机硒、锗，是天然的强抗氧 化剂，可 清除体内自由基，使 蓄积 在人 体内的毒素和废物被氧化，增 加血液中的含氧量，促进新陈代谢和微循环。 对于高血脂、高血糖、脂肪 肝、冠心病、高血压，甲、乙型肝炎的治疗以及癌症术后放化疗病人的康 复有非常好的辅助作用。栽培或野生。全国大部分地区多有生产，尤以长 江中下游及四川盆地桑区为多。原植物喜温暖湿润气候，稍耐荫，耐旱， 不耐涝，耐贫瘠，对土壤适应性强。味苦、甘，性寒。归肺、肝经。功效 疏散风热、清肺润燥、清肝明目。临床上习惯认为经霜者质佳，称“霜桑 叶”或“冬桑叶”，饮片名称桑叶、蜜炙桑叶。 提高桑叶产量，是发展蚕桑丝绸事业的基础，而经营好桑园又是桑叶 丰产的根本。中国的农学家们在桑树良种的选育、桑树用肥、桑树病虫害 的防治和桑园管理等方面，不断地深入研究并取得了丰硕的成果，现经收 集整理和新育成的桑品种已有千余个。如浙江和江苏有湖桑和火桑两个桑 品种群。湖桑一般枝条粗长，叶形大，硬化迟，适应性强，多数属中生和 晚生品种。火桑有红皮火桑和白皮火桑，其新梢嫩叶呈紫红色，均属早生 品种。四川有川南乐山嘉定桑，枝条长，叶稀叶质好；川东北的冠桑枝条 细直，皮色青灰。山东有鲁桑，枝条粗短、节密、硬化早、耐寒。而对桑 叶的保鲜，对发展蚕桑丝绸事业也有重大的意义。如何防止桑叶的褐变现 象发生，对桑叶多酚氧化酶的研究则是必不可少的项目。 1.1.2 多酚氧化酶的简介 多酚氧化酶是一种蛋白体，在茶树生命活动和茶叶加工过程中参与一 系列由酶促活动而引起的化学变化，故又被称为生物催化剂。多酚氧化酶 (Polyphenol Oxidase,PPO;氧化还原酶)是 2 一种金属蛋白酶，能 催化邻-苯二酚氧化成邻-苯二醌，也能作用于单酚单 加氧酶的底物。其普遍存在植物、真菌、昆虫的质体中，在自然 界中分 布及其广泛。由于其检测方便， 是被最早研究的几类酶之一。它 主要 由铜离子辅基和主酶两部分组成,铜离子辅基不可透析。茶叶中的酶较为复 杂，种类很多，包括氧化还原酶、水解酶、裂解酶、磷酸化酶、移换酶和 同工异构酶等几大类。酶蛋白具有一般蛋白质的特性，在高温或低温条件 下有易变性失活的特点。各类酶均有其活性的最适温度范围，一般在 3050范围内酶活性最强。酶若失活、变性，则就丧失了催化能力。 酶的催化作用具有专一性，如多酚氧化酶，只能使茶多酚物质氧化，聚合 成茶多酚的氧化产物茶黄素、茶红素和茶褐素等；蛋白酶只能促使蛋白质 分解为氨基酸。多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）是自然界中分布极 广的一种金属蛋白酶，普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中，甚至在土 壤中腐烂的植物残渣上都可以检测到多酚氧化酶的活性。由于其检测方便， 是被最早研究的几类酶之一。自 1883 年 Yoghid 发现日本漆树液汁变硬可 能和某种活性物质相关，1938 年 Keilin D.和 Mann G.研究了蘑菇多酚氧化 酶的提取和纯化，得到多酚氧化酶并将这类酶称为 polyphenol oxidase。多 酚氧化酶又称儿茶酚氧化酶，酪氨酸酶，苯酚酶，甲酚酶，邻苯二酚氧化 还原酶，是六大类酶中的第一大类氧化还原酶1-9. 多酚氧化酶是一种蛋白体，在茶树生命活动和茶叶加工过程中参与一 系列由酶促活动而引起的化学变化，故又被称为生物催化剂。茶叶中的酶 较为复杂，种类很多，包括氧化还原酶、水解酶、裂解酶、磷酸化酶、移 换酶和同工异构酶等几大类。酶蛋白具有一般蛋白质的特性，在高温或低 温条件下有易变性失活的特点。各类酶均有其活性的最适温度范围，一般 在 3050范围内酶活性最强。酶若失活、变性，则就丧失了催化能力。 酶的催化作用具有专一性，如多酚氧化酶，只能使茶多酚物质氧化，聚合 成茶多酚的氧化产物茶黄素、茶红素和茶褐素等；蛋白酶只能促使蛋白质 分解为氨基酸10-16。茶叶加工就是利用酶具有的这种特性，用技术手段钝 化或激发酶的活性，使其沿着茶类所需的要求发生酶促反应而获得各类茶 特有的色香味。如绿茶加工过程中的杀青就是利用高温钝化酶的活性，在 短时间内制止由酶引起的一系列化学变化，形成绿叶绿汤的品质特点。红 茶加工过程中的发酵就是激化酶的活性，促使茶多酚物质在多酚氧化酶的 3 催化下发生氧化聚合反应，生成茶黄素、茶红素等氧化产物，形成红茶红 叶红汤的品质特点。 多酚氧化酶的共同特征是能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌。 在广义上，多酚氧化酶可分为三大类：单酚单氧化酶(酪氨酸酶 tyrosinase,EC.1.14.18.1)、双酚氧化酶(儿茶酚氧化酶 catechol oxidse,EC.1.10.3.2)和漆酶(laccase,EC.1.10.3.1)。在这三大类多酚氧化酶中， 儿茶酚酶主要分布在植物中，微生物中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪氨 酸酶。现在大部分文献所说的多酚氧化酶一般是儿茶酚氧化酶和漆酶的统 称。在植物(如苹果、荔枝、菠菜、马铃薯、豆类、茶叶、桑叶、烟草等) 组织中，PPO 是与内囊体膜结合在一起的，天然状态无活性，但将组织匀 浆或损伤后 PPO 被活化，从而表现出活性。在果蔬细胞组织中，PPO 存在 的位置因原料的种类、品种及成熟度的不同而有差异，绿叶中 PPO 活性大 部分存在于叶绿体内；马铃薯块茎中几乎所有的亚细胞部分都含有 PPO， 含量大约与蛋白质部分相同；在茶叶中的 PPO 分为游离态和束缚态，前者 主要存在于细胞液中属可溶态 PPO，而后者则主要存在于叶绿体、线粒体 等细胞器中，与这些细胞器的膜系统或其他特异部位结合呈不溶态， ThanarajS.N.(1990)研究了茶树新梢中 PPO 活性及多酚含量对红茶品质的影 响，发现 PPO 活性强，多酚含量高，对红茶品质有利，相反则利于绿茶的 生产；新鲜的苹果中，多酚氧化酶几乎全部存在于叶绿体和线粒体中。从 这两部分分别制备的 PPO，其底物专一性稍有差异。刘乾刚认为，PPO 在 细胞内除了存在于叶绿体及线粒体上外，细胞壁也可能存在 PPO，且对发 酵产生影响，细胞只要轻微破损便有 PPO 的作用。多酚氧化酶是一种质体 酶，有些研究人员认为多酚氧化酶可能仅存在于质体中，缺乏质体的组织 就不存在多酚氧化酶，例如筛管和筛胞等，但是有质体的组织也可能没有 多酚氧化酶，如 C4 植物叶。含有质体的植物组织不一定都存在多酚氧化酶， 而多酚氧化酶一定在含有质体的植物组织中。随分子生物学的发展，象西 红柿、苹果等的多酚氧化酶的基因已被克隆。浙江大学赵东等对茶树多酚 氧化酶的克隆及其序列进行了比较。从已经克隆的多酚氧化酶的基因看， 均属于基因家族，多则 6-7 个基因。这些基因的表达具有时空差异和组织特 异性（PPO 在幼龄组织中表达，在成熟组织中不表达） ，表明多酚氧化酶的 4 基因在植物中所起的作用不同。高等植物组织发生褐变主要是 PPO 作用的 结果，PPO 催化多酚氧化为醌，醌聚合并与细胞内蛋白质的氨基酸反应， 结果产生黑色素沉淀17-19。 常用检压法和分光光度法。前者应用多酚氧化酶(PPO)可催化儿茶素等 底物在有氧条件下的氧化还原反应，根据底物的氧化速率与单位酶浓度和 单位时间内的耗氧量成正比这一原理，用瓦氏呼吸仪测定反应过程中的耗 氧量求得 PPO 活性的大小，此方法设备简便，但操作复杂，误差较大。后 者利用邻苯二酚和 D-儿茶素在 PPO 催化下生成有色产物.其显色物质在 460 纳米处有最大吸收，吸收值在单位时间内的变化和单位酶活性成正比， 计算 PPO 活性强度。操作方法简便，重现性好。与检压法原理相似的方法 有氧电极法，应用也较多。 1.2 桑叶多酚氧化酶的研究意义 饲料在加工过程中或长期贮存于湿热环境下，其所含的氨基化合物如 蛋白质、氨基酸及醛、酮等与还原糖相遇，经过一系列反应生成褐色聚合 物的现象称为褐变反应，简称褐变。 酶促褐变多发生在水果蔬菜等新鲜植物性食物中，是酚酶催化酚类物 质形成醌及其聚合物的结果。 植物组织中含有酚类物质，在完整的细胞 中作为呼吸传递物质，在正常的情况下，氧化还原反应之间(酚和醌的互变)保 持着动态平衡，当组织破坏后氧就大量侵入，打破了氧化还原反应的平衡， 于是发生了氧化产物醌的积累和进一步聚合及氧化，形成黑色。 催化酶促褐变的酶有酚酶、抗坏血酸脱氢酶、过氧化物酶等。酚酶是 以氧为受氢体的末端氧化酶，是两种酶的复合体，其一是甲酚酶（又称酚 羟化酶），作用于一元酚，另一是儿茶酚酶（又称为多元酚氧化酶），作 用于二元酚。也有人认为酚酶是既能作用一元酚，又能作用于二元酚的一 种特异性不强的酶。 PPO 与抗病性的关系人们已进行了广泛的研究。植物在抵御病原微生 物的侵染过程中，抗性相关酶发挥了重要作用，这主要包括了酚类代谢系 统中的一些酶和病原相关蛋白家族 PPO 通过催化木质素及醌类化合物形成， 构成保护性屏蔽而使细胞免受病菌的侵害，也可以通过形成醌类物质直接 发挥抗病作用。目前已比较成功的有:黄瓜对黑星病的抗性，苹果对轮纹病 5 的抗性，香蕉对束顶病的抗性，柠檬对流胶病的抗性，甘薯对蔓割病的抗 性，水稻对白叶枯病的抗性等等20-23。 茶叶中所有化学成分中，儿茶素与多酚氧化酶尤为重要，除绿茶、黄 茶外，各种茶叶的加工都是基于儿茶素在多酚氧化酶催化下的氧化作用， 即所谓的“发酵”过程。有的学者在红碎茶加工中，利用茶幼果作为外源 PPO 的载体，以一定比例用于红碎茶加工过程，结果发现能明显提高成茶的 TF 含量，减少 TB 含量。还有的学者进行了内源酶发酵研究，以期望能在 茶饮料中有所应用，改善滋味。 多酚氧化酶是引起果蔬酶促褐变的主要酶类，PPO 催化果蔬原料中的 内源性多酚物质氧化生成黑色素，严重影响制品的营养，风味及外观品质。 这些情况对生产者与消费者均是不希望看到的，仅在少数几种食品的生产 中，人们利用了 PPO 的作用，如茶叶、咖啡、黑葡萄中的多酚氧化酶。 对 PPO 的酶学性质研究主要包括酶的分离与纯化、 酶促反应速度的测 定、影响酶促反应速度的各种因素等。 酶的分离与纯化 PPO 的分离一般是将生物材料加入适宜的缓冲液进行 打浆或研磨提取酶蛋白，然后通过离心(高速冷冻离心)分离得到粗酶液， 再通过分级盐析、葡 聚糖凝胶(Sephadex)层析及 DEAE 纤维素离子交换层 析 等方法进行纯化 ，可得比活大、纯度高的 PPO 酶液以进行若干酶学性 质研究。 PPO 活性测定 PPO 活性测定从理论上讲可以测定底物消耗速度或产物 生成速度，但现在人们通常采用测定 产物生成速度。不论哪种方法测定的 都应是初速度。测定产物生成速度(初速度)一般采用分光光度法，即在一 定波长下测定从醌生成的色素的吸光度(A 或 0D 值)，根据吸光度来定 义酶活性。对蕨菜多酶氧化酶的活性测定 ，均是用分光光度法测定 0D 值并进行酶活性定义的，不过对不同来源的 PPO 活性测定人们所采用的波 长、底物、反应时间以及具体酶活性定义常常有一定差异，从而导致不同 的人研究的 PPO 活性往往无法进行直接比较。 影响酶促反应速度因素的研究影响 PPO 反应速 度的因素主要有 pH 值、 不同温度、不同底物、同一底物不同浓度、抑制剂、激活剂等。文献以及 作者对蕨菜 PPO 酶学性质的研究，均对这些影响酶促反应速度的因素进行 了研究。 6 1911-1912 年间 BernaLd 和 WeLter 沿用 Marn 的酶提取方法（鲜叶加兽 皮粉捣碎，再以乙醇沉淀，最后得到白色干燥粉，即为酶制剂），早期分 离得到的酶大多数是不溶性的，活力很低。后来学者通过在提取的过程中 加入多酚吸附剂才分离出可溶行的多酚氧化酶。1993 年 Coggon 等人采用 液氮低温冷冻提取，pH7.0,加入吐温 80 或用葡聚糖凝胶 G-50，该方法能获 得活力较高的可溶性多酚氧化酶。在一般材料中的多酚氧化酶的研究多采 用丙酮粉法和缓冲液匀浆法。杨朝柱等进行小麦活性检测采用的是缓冲液 匀浆法，而在枣果实多酚氧化酶性质的研究中宗亦臣等则采用的是丙酮粉 法。综合目前学者的研究现状，多酚氧化酶一般采用如下几种提取方法：1. 丙酮粉法 2. 匀浆法 3. 匀浆浸提法。在这些方法中，有实验者表明丙酮粉 法对酶提取活性损失较大，活性得率较低，但其酶粉活性尚可、体积小