伪狂犬病检测方法.doc

十一、伪狂犬病检测方法伪狂犬病病毒分离鉴定1 材料准备 DMEM培养基、BHK-21细胞、新生犊牛血清、青霉素、链霉素溶液、0.22ul微孔滤膜、细胞培养瓶、CO2培养箱、倒置显微镜。溶液配制见附录A(标准的附录)2 操作步骤2.1 病料的采集 对于刚死亡或活体送检并处死的动物，无菌采取肝、脾、肺、肾及其脑组织，尤其是三叉神经节、嗅球， 4送实验室检测。2.2 样品处理 待检组织在灭菌乳钵内剪碎，加入灭菌玻璃砂研磨，用灭菌生理盐水或DME培养基制成1：5乳剂，70反复冻融后，经3000rpm离心30分钟后，取上清液经0.22m微孔滤膜过滤后，加入青链霉素溶液至最终浓度为100U/mL，70保存作为接种材料。2.3 病料接种 将病料滤液接种已长成单层的BHK-21细胞，接种量为培养基量的10%，37恒温箱中吸附1小时后，加入含10%新生犊牛血清（经过56水浴灭活30分钟，过滤除菌，无支原体）的DMEM培养基，置37温箱中培养。2.4 观察结果 接种后2448小时，BHK-21细胞应出现典型的细胞病变效应（Cyto pathogenic effect, CPE），表现为细胞变圆，脱落。如第一次接种不出现CPE，应将细胞培养物冻融后盲传三代，如仍无CPE，则判为伪狂犬病病毒阴性。2.5 病毒的鉴定 将出现CPE的细胞培养物反复冻融后，用聚合酶链式反应、荧光抗体试验等两种方法中任一方法作进一步鉴定。伪狂犬病聚合酶链式反应1 材料准备:待检组织、组织匀浆器、蛋白酶K，十二烷基磺酸钠（SDS），苯酚、氯仿，异戊醇（分析纯）、TEN缓冲液。溶液配制见附录C(标准的附录)引物：扩增伪狂犬病病毒基因中434651bp之间217bp基因片段，由上海生物工程公司合成。序列为，上游引物P1：5-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3，下游引物P2：5-GTCCACGCCC-CGCTTGAAGCT-3 仪器设备有：凝胶电泳紫外线检测仪， PCR扩增仪，电泳仪2操作步骤：21 样品的采集：对于病死或扑杀动物，取脑组织；对于待检活猪，用已灭菌的棉签，伸入猪鼻腔中，采取鼻粘液，即为鼻拭子，冷藏条件送实验室检测。2.2 样品处理 所采病料经组织研磨器充分研磨，按1:5用TEN缓冲液悬浮收集于离心管内，-70反复冻融3次，7000r/min离心5min，如样品为鼻试子，则加入2ml TEN缓冲液，充分挤压，取出棉签，7000rpm，离心5分钟，取上清液。取上清液472.5l,加入25l 10SDS和2.5l的20mg/ml 蛋白酶K，50水浴摇床上放置2h后加入等量的饱和酚500l，涡旋20s。离心取上清液，加等量的酚：氯仿：异戍醇（25:24:1）抽提一次，再用氯仿：异戍醇（24：1）抽提一次，最后用乙醇沉淀，真空抽干后加入20l双蒸水溶解，-20贮存备用。2.3. PCR的操作程序 先将制备的模板DNA置100水浴10分钟作变性处理，然后立即放于冰浴中。PCR反应体系为：总体积25l，含有50m mol/L KCl,10m mol/L Tris-HCl（pH 9.0），0.1Triton X-100，100mol/L dNTPs，0.35mol/L引物，2 m mol/L MgCl2，及0.5U Taq酶，1l模板DNA。常用的反应体系组成如下 10缓冲液 2.5 l 15mM MgCl2 2.5 l dNTPs 2.0 l 引物 各2.0l Taq聚合酶 1.0l DNA模板 2.0l 灭菌去离子水 11.0l 矿物油 约 20l 扩増条件为:94变性3分钟，进入循环，9460秒，6560秒，7260秒，40个循环后72延伸5分钟。2.4 PCR产物的检测 PCR扩增产物在1的琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭染色，在紫外光下观察结果。为进一步进行PCR扩增产物的特异性鉴定，可取PCR产物用SalI酶切，酶切产物在2琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外光下观察并与标准分子量比较，可见产生的140bp和77bp两个片段。伪狂犬病荧光抗体试验1材料准备：碳酸盐缓冲甘油、磷酸盐缓冲液、丙酮（分析纯），伪狂犬病荧光抗体、冰冻切片机，荧光显微镜。溶液配制见附录D(标准的附录)2操作步骤21样品采集 扑杀可疑动物，取大脑、淋巴结、扁桃体迅速送检实验室，如不能及时送出，必须冻结保存，避免腐败、自溶。本法也可用于对疑似伪狂犬病病毒的培养物进行鉴定。22 切片制备 将样品组织块切成1cm1cm的面，不经任何固定处理，直接贴于冰冻切片托上，进行切片，切片厚度要求57um，将切片展贴于0.8mm1mm厚的洁净载玻片上。23固定：将切片置纯丙酮中固定15分钟，取出立即放入0.01mol/L，pH7.2的磷酸盐缓冲液中，轻轻漂洗34次，取出，自然干燥后尽快进行荧光抗体染色。24 染色 将伪狂犬病荧光抗体滴加于切片表面，置温盒内于37作用30分钟，取出后放入磷酸盐缓冲液中充分漂洗，再用0.5moL/L，pH9.09.5碳酸盐缓冲甘油封固盖片（0.1mm厚），染色后应尽快镜检，必要时可放置低温待检。25 观察 将染色后的切片标本置激发光为蓝紫光或紫外光的荧光显微镜下观察。26判定：于荧光显微镜视野中，见细胞中出现明亮的黄绿色荧光，判为伪狂犬病病毒感染阳性。伪狂犬病微量中和试验（固定病毒，稀释血清法）1 材料准备0. 25%胰酶（配制见附录B）、BHK-21细胞,多道可调微量移液器, ,96孔细胞培养板,CO2培养箱, 倒置显微镜。2 操作步骤2.1 病毒半数组织细胞感染量（TCID50）的测定：2.1.1 病毒培养和收获 将伪狂犬病毒接种于长成单层的BHK-21细胞，接种量为液体培养基量的10%,37培养，待出现病变后，冻融，收获病毒。2.1.2 病毒的滴定 用DMEM培养基将伪狂犬病病毒作连续10倍稀释，即101、102每个稀释度取100L加入96孔细胞培养板中，随后加入经0.25%胰酶消化的BHK-21细胞100L（细胞含量以105/mL左右 为宜），每个稀释度作8个重复，并设空白细胞培养对照。置37 5%CO2培养箱中。 2.1.3 TCID50计算 逐日观察细胞病变，并记录细胞病变孔数，直到对照细胞老化脱落为止。按照Reed-Muench法计算病毒的TCID50（具体的计算示例见附录B）。2.2 中和试验 将无菌采集的待检猪血清置56水浴灭活30分钟。用DMEM培养基作倍比稀释，在细胞培养板各孔中加入50L培养基，随后在第一孔中加入经待检猪血清50L混合后，用微量移液器取出50L，加到第二孔中，混匀后取出50L再加入第三孔中，依此类推。血清稀释度即为1：2、1：4、1：8，每份待检血清稀释度作24个重复。将50L含200个TCID50的病毒液加入到不同稀释度血清孔中，37作用1小时，每孔中再加入100L经胰酶消化分散的BHK-21细胞，同时设病毒对照、阳性血清、阴性血清，待检血清、正常细胞对照。2.3计算抗体中和效价 逐日观察，直至细胞对照出现老化脱落为止，按Reed-Muench两氏法，计算抗体中和效价。如抗体效价为1：2及1：2以上，则判为伪狂犬病抗体阳性。伪狂犬病酶联免疫吸附试验（间接法）1材料准备：抗原、酶标抗体，底物（OPDH2O2），酶联免疫检测仪；溶液配制见附录F(标准的附录)2 操作步骤：2.1 包被 将PRV抗原加入酶标板孔内，每孔100uL，37作用1h后置4冰箱过夜。2.2 洗涤 弃去孔内液体，用洗涤液洗3次，每次3min，用吸水纸拍干2.3 封闭 各孔加入封闭液100uL 37作用1h。按2.2步骤洗涤24 加入待检血清 待检血清经56oC30分钟灭活将待检血清用洗涤液稀释，每孔100uL，37作用1h。重复2.2步骤。25 加入酶标抗体 用洗涤液将酶标抗体按工作浓度稀释，每孔100uL，37作用1h。重复2.2步骤。26 加入底物（OPD-H22）：每孔100uL，室温避光显色25分钟。27 终止反应 每孔加入50uL终止液终止反应。28 测定OD值 在酶联免疫检测仪上490nm波长处读数。29血清阴阳性判定标准的确定 取60份经中和试验检测为PRV抗体阴性的猪血清，按1:20稀释后进行间接ELISA试验，测定490nm波长处OD值，规定以60份血清的平均OD值加上3倍标准差作为判定阴阳性的临界值。伪狂犬病乳胶凝集试验1材料准备：伪狂犬病乳胶凝集抗原、伪狂犬病阳性血清、阴性血清、稀释液，玻片，溶液配制见附录E(标准的附录)2操作步骤：21待检血清不须经热灭活或其它方式的灭活处理22将待检血清用稀释液作倍比稀释后，各取15L与等量乳胶凝集抗原在洁净干燥的玻片上用竹签搅拌充分混合，在35分钟内观察结果；可能出现以下几种凝集结果，即： 100%凝集：混合液透亮，出现大的凝集块 75%凝集：混合液几乎透明，出现大的凝集块 50%凝集：约50%乳胶凝集，凝集颗粒较细 25%凝集；混合液浑浊，有少量凝集颗粒 0%凝集：混合液浑浊，无凝集颗粒出现 如出现50%凝集程度以上的（含50%凝集程度），判为伪狂犬病抗体阳性，否则判为抗体阴性。如为阴性，可用微量中和试验进一步检测。伪狂犬病琼脂扩散试验1材料准备 琼脂扩散抗原、阴性血清和阳性血清；优质琼脂粉、平皿2操作步骤21 0.8%琼脂板的制作 将1克琼脂粉溶于100毫升Tris盐酸缓冲液(Tris 6.5克, NaCl 2.9克, NaN3 0.2克, 蒸馏水 1000毫升, 用HCl调pH值至7.2)中，趁热倾倒于玻璃平皿上，厚度为23mm，待冷却凝集后，打孔，中央一孔，周围6孔，孔径为2mm，周围孔之间距离2mm，周围孔与中央孔间距为4mm6mm，用酒精灯微热封底。22加样 将琼脂扩散抗原加到中央孔中，周围孔加经热灭活的待检血清，设阴性血清和阳性血清对照。置温盒37作用，2448小时后观察结果。23结果判定 在抗原孔与待检血清孔之间出现白色沉淀线，抗体可判为阳性；如待检血清抗体水平较低，可以观察到与待检血清相邻的阳性血清沉淀线末端略向抗原抗弯曲。阴性血清与抗原孔之间则没有沉淀线。伪狂犬病区分强弱毒感染鉴别乳胶凝集试验1猪伪狂犬病gG鉴别诊断乳胶凝集试验伪狂犬病gG鉴别诊断乳胶凝集试验是用伪狂犬病毒gG基因的基因工程表达产物致敏乳胶抗原来检测动物血清、全血或乳汁中抗gG蛋白的抗体。用于伪狂犬病毒感染猪与gG基因缺失疫苗注苗猪的免疫学鉴别诊断。11材料准备：伪狂犬病毒gG蛋白致敏乳胶抗原、伪狂犬病毒致敏乳胶抗原、伪狂犬病毒阳性血清和注射gG基因缺失疫苗血清、玻片、吸头等。12操作步骤121对照试验 检测之前应做对照试验，出现如下结果试验方可成立，否则应重试，如重试仍不出现如下结果则停止使用：伪狂犬病毒阳性血清加gG蛋白致敏乳胶抗原呈阳性凝集；注射gG基因缺失疫苗血清加gG蛋白致敏乳胶抗原呈阴性凝集；伪狂犬病毒阳性血清与注射gG基因缺失疫苗血清加伪狂犬病毒致敏乳胶抗原均呈阳性凝集。122检测试验1221待检血清不须经热灭活或其它方式的灭活处理1222待检血清一滴，置于玻片上。加gG蛋白致敏乳胶抗原一滴，用牙签混匀，搅拌并摇动1-2分钟，于3-5分钟内观察结果(注：gG蛋白致敏乳胶抗原与血清反应的凝集颗粒较细)；可能出现以下几种凝集结果，即： “+”全部乳胶凝集，颗粒聚于液滴边缘，液体完全透明； “+”大部分乳胶凝集，颗粒明显，液体稍混浊； “+”约一半乳胶凝集，但颗粒较细，液体较混浊； “+”有少许凝集，液体呈混浊； “”液滴呈原有的均匀乳状。以出现“+”以上凝集者判为阳性凝集。2猪伪狂犬病gE鉴别诊断乳胶凝集试验伪狂犬病gE鉴别诊断乳胶凝集试验是用伪狂犬病毒gE基因的基因工程表达产物致敏乳胶抗原来检测动物血清、全血或乳汁中抗gE蛋白的抗体。用于伪狂犬病毒感染猪与gE基因缺失疫苗注苗猪的免疫学鉴别诊断。11材料准备：伪狂犬病毒gE蛋白致敏乳胶抗原、伪狂犬病毒致敏乳胶抗原、伪狂犬病毒阳性血清和注射gG基因缺失疫苗血清、玻片、吸头等。12操作步骤121对照试验 检测之前应做对照试验，出现如下结果试验方可成立，否则应重试，如重试仍不出现如下结果则停止使用：伪狂犬病毒阳性血清加gE蛋白致敏乳胶抗原呈阳性凝集；注射gE基因缺失疫苗血清加gE蛋白致敏乳胶抗原呈阴性凝集；伪狂犬病毒阳性血清与注射gE基因缺失疫苗血清加伪狂犬病毒致敏乳胶抗原均呈阳性凝集。122检测试验1221待检血清不须经热灭活或其它方式的灭活处理1222待检血清一滴，置于玻片上。加gE蛋白致敏乳胶抗原一滴，用牙签混匀，搅拌并摇动1-2分钟，于3-5分钟内观察结果(注：gE蛋白致敏乳胶抗原与血清反应的凝集颗粒较细)；可能出现以下几种凝集结果，即： “+”全部乳胶凝集，颗粒聚于液滴边缘，液体完全透明； “+”大部分乳胶凝集，颗粒明显，液体稍混浊； “+”约一半乳胶凝集，但颗粒较细，液体较混浊； “+”有少许凝集，液体呈混浊； “”液滴呈原有的均匀乳状。以出现“+”以上凝集者判为阳性凝集。伪狂犬病区分强弱毒感染鉴别ELISA1伪狂犬病gG-ELISA鉴别诊断（间接法）伪狂犬病gG-ELISA鉴别诊断是用伪狂犬病毒gG基因的基因工程表达产物包被的ELISA板用来检测动物血清中抗gG蛋白的抗体。用于伪狂犬病毒感染猪与gG基因缺失疫苗注苗猪的免疫学鉴别诊断。11材料准备：gG蛋白包被的ELISA板、酶标抗体，底物（OPDH2O2），酶联免疫检测仪；溶液配制见附录F(标准的附录)12 操作步骤：12.1加入待检血清 待检血清经56oC30分钟灭活后用保温液作40倍稀释，每孔加入，37作用30min。12.2 洗涤 弃去孔内液体，每孔用200uL洗涤液洗3次，每次3min，用吸水纸拍干。12.3 加入酶标抗体 用洗涤液将酶标抗体按工作浓度稀释，每孔100uL，37作用30min,重复2.2步骤。 124 加入底物（OPD-H2O2）：每孔100uL，室温避光显色25分钟。125 终止反应 每孔加入50uL终止液终止反应。 126 测定OD值 在酶联免疫检测仪上490nm波长处读数。测定490nm波长处OD值，记为P值，阴性对照OD值记为N值，N值如小于0.1时，按0.1计算，大于0.1时为实际值。当阳性对照孔OD值阴性对照OD值大于0.25时，试验成立。127结果判定：P/N2.1判为gG抗体阳性P/N1.9判为gG抗体阴性,1.9PN2.1,判为可疑2伪狂犬病gE-ELISA鉴别诊断（间接法）伪狂犬病gE-ELISA鉴别诊断是用伪狂犬病毒gE基因的基因工程表达产物包被的ELISA板用来检测动物血清中抗gE蛋白的抗体。用于伪狂犬病毒感染猪与gE基因缺失疫苗注苗猪的免疫学鉴别诊断。21材料准备：gE蛋白包被的ELISA板、酶标抗体，底物（OPDH2O2），酶联免疫检测仪；溶液配制见附录F(标准的附录)22 操作步骤：22.1加入待检血清 待检血清经56oC30分钟灭活后用保温液作40倍稀释，每孔加入，37作用30min。22.2 洗涤 弃去孔内液体，每孔用200uL洗涤液洗3次，每次3min，用吸水纸拍干。22.3 加入酶标抗体 用洗涤液将酶标抗体按工作浓度稀释，每孔100uL，37作用30min,重复2.2步骤。 224 加入底物（OPD-H2O2）：每孔100uL，室温避光显色25分钟。225 终止反应 每孔加入50uL终止液终止反应。 226 测定OD值 在酶联免疫检测仪上490nm波长处读数。测定490nm波长处OD值，记为P值，阴性对照OD值记为N值，N值如小于0.1时，按0.1计算，大于0.1时为实际值。当阳性对照孔OD值阴性对照OD值大于0.25时，试验成立。227结果判定：P/N2.1判为gE抗体阳性P/N1.9判为gE抗体阴性1.9PN2.1,判为可疑伪狂犬病病毒血凝（HA）与血凝抑制（HI）试验方法 （一）红血球的制备：将小白鼠尾尖剪断，插入盛有灭菌的阿氏液的离心管的抽气瓶中，负压抽吸，采血完毕后，将离心管取出，用PBS洗涤3次，每次1 500转/分钟离心10分钟，使用时加PBS配成0.1%的红血球悬液。 （二）待测血清的预处理：取待测血清0.1毫升加PBS 0.3毫升，56灭活30分钟，加入0.4毫升 25%白陶土25振荡1小时，离心取上清液加入0.1毫升配好的0.1%红血球悬液37作用1小时,离心除去红血球,上清液作为1:8稀释的血清用于HI试验. （三） HA试验操作:选用96孔V型板每孔加入PBS 50微升,在第一排孔的前6孔内加入50微升 PrV病毒液,后两孔作为空白对照,用微量加样器作倍比稀释,从1:2至1:1024,即将第一排孔病毒液混匀后吸出50微升至第二排孔均匀混合,再从第二排孔吸出50微升至第三排孔,依次类推至最后一排孔取50微升弃掉,每孔加入50微升 0.1%的红血球，在振荡器较微振荡混合均匀，以一定的温度作用2小时，观察结果，以完全凝集红血球的最大稀释倍数作为一个血凝单位。 （四）HI试验操作：在96孔V型板中每孔加入50微升 PBS液，然后在第一排孔的前6孔内加入50微升已处理的血清作为对照，用微量加样器将血清倍比稀释从1：2至1：1 024，然后各孔加入50微升用PBS稀释好的4个血凝单位的病毒液，每孔分别加入50微升 0.1%红血球悬液，混合均匀后室温放置2小时，观察结果。(吴 斌 何启盖)进口伪狂犬病抗体检测试剂盒（用于普查）一、 试剂 贮存在2-71 PRV包被酶标板 5块2 抗猪辣根过氧化物酶（HRP）连结物（酶标抗体） 60ml3 PRV阳性对照血清 4ml4 PRV阴性对照血清 4ml5 样品稀释液 175ml6 洗涤液（10） 250ml7 TMB底物 60ml8终止液 60ml二、样品的准备用样品稀释液按1：20稀释待检血清。（如20ul样品加380ul样品稀释液）。注意：阴、阳性对照不稀释。每一样品必须更换吸嘴，并记录样品在板上的位置，在样品加到酶标孔内之前必须混合均匀。三、洗涤液的准备浓缩洗涤液（10）应置室温并摇动使沉淀的盐能充分溶解。在用之前，浓缩洗涤液（10）应用蒸馏水或去离子水接1：10稀释（如30ml浓缩洗涤液加 270ml蒸馏水或去离子水即可用于一块板的洗涤）。四、试验过程在使用之前所有试剂必须置室温并轻轻摇动或涡旋。1取出酶标板并记录样品在板上的位置。2在A1、A2、A3孔内各加未稀释的阴性对照100ul。3在A4、A5、A6孔内各加未稀释的阳性对照100ul。4加100ul已稀释的样品（1：20）到相应的孔内，每一样品应同时做2孔。5室温作用30分钟。6倾去孔内液体到废液缸内。7每孔用近300ul的洗涤液洗3-5次，每次洗后倾去孔内的液体。在加酶标抗体之前应避免孔内干燥，最后一次洗涤后应在吸水材料上拍干酶标板。8 在每一孔内加入100ul抗猪的酶标抗体。9 室温作用30分钟。10重复步骤6和7。11 在每一孔内加入TMB底物溶液100ul。12 室温显色15分钟。13 每一孔内加入100ul终止剂以终止反应。14 空气调零。15 在650nm测量并记录样品和对照的吸收值。16 计算结果。五、结果 阳性对照的平均值（PCX）与阴性对照的平均值（NCX）之差（P-N）大于或等于0.15时试验方成立。而且阴性对照平均值（NCX）必须小于或等于0.15。如果试验不成立，可能操作有误，试验应在熟悉产品说明书后重试。每一样品内针对PRV抗体的有无是由样品与阳性对照的比率（S/P）来确定。阳性对照已标准化且有很高水平的PRV抗体。六、 结果的说明1 S/P比值小于0.4的样品确定为PRV抗体阴性。2 S/P比值大于或等于0.4的样品确定为PRV抗体阳性。在该试验中定为阳性的样品应再用“伪狂犬病抗体确认试剂盒”来进一步证明其阳性的真假。七、计算1 阴性对照平均值（NCX）的计算 A1A（650）+A2A（650）+A3A（650） 0.06+0.063+0.069NCX= 例如：=0.064 3 3 2 阳性对照平均值（PCX）的计算 A4A（650）+A5A（650）+A6A（650） 0.313+0.299+0.33NCX= 例如：=0.314 3 3 3 S/P比值的计算 例如：某样品平均值=0.350 Sample A（650）NCX 0.350-64 0.286S/P= S/P= = =1.14 PCXNCX 0.314-0.064 0.250（华中农大覃雅丽、唐勇译）伪狂犬病gE抗体试剂盒（进口）一、试剂 贮存在2-71. PRV包被酶标板 6块2. 抗 PRV-gE辣根过氧化物酶（HRP）连结物（酶标抗体） 60ml3. 阴性猪血清对照-不与PRV-gE 反应的猪血清 5ml4. 阳性对照血清-抗PRV-gE 5ml5. 样品稀释液 120ml6. 洗涤液（10） 235ml7. TMB底物 60ml8. 8终止液 60ml二、样品的准备用样品稀释液按1：2 的比例稀释待检血清。每一样品必须更换吸嘴，样品加到酶标孔内之前必须混合均匀。三、洗涤液的准备浓缩洗涤液（10）应平衡到室温，摇动使沉淀的盐能充分溶解。在用之前，浓缩洗涤液（10）应用蒸馏水或去离子水按1：10稀释（如30ml浓缩洗涤液加 270ml蒸馏水或去离子水即可用于一块板的洗涤）。四、试验过程在使用之前