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文档简介
1 分子医学实验学 实实 验验 指指 导导 供口腔、护理、药学各专业用供口腔、护理、药学各专业用 (第一版)(第一版) 佛山科学技术学院医学院编佛山科学技术学院医学院编 20082008 年年 6 6 月月 2 编编 写写 说说 明明 分子医学实验学是一门集生物化学、免疫学、生物化学技 术和分子生物学基本实验、科研探索和医学应用于一体的全新的综 合性实验课程。其实验技术反映现代生物医学发展趋势。分子医 学实验是基础医学实验教学的重要组成部分,是医学各本科专业 的专业基础必修课。课程内容包括分子医学基本实验技术、基础实 验及综合和设计性实验等部分。课程的主要目的一是强化基础知识 教育,突出基本技能训练,是使学生能掌握分子医学的经典理论和 基本实验,二是培养学生综合性素质,开发学生的科研潜能和创新 思维。开设分子医学实验学的目的在于:1、验证和巩固理论知识, 加深对理论知识的全面理解,加强记忆。2、通过实验,掌握分子医 学实验学的基本操作技术,掌握层析法,电泳法,分光光度法和生物 大分子制备等常用的实验方法的基本原理,熟悉分子医学实验的一 般知识。3、培养学生观察、比较、思考及分析问题和解决问题的能 力,使学生具备一定的动手操作能力、创新能力培养学生科学、严 谨、认真工作态度及理论联系实际、实事求是的工作作风。 本实验指导 11 个实验项目涵盖了分子医学实验学中沉淀、离心、 层析、电泳、分光光度测定等分子医学实验的基本方法,可依实验 所需时间作合理组合实验,根据实验条件和教学安排适时开课。 3 实实 验验 室室 规规 则则 1实验前必须预习实验指导和相关理论知识,明确实验目的、原 理、预期的实验结果、操作关键步骤及注意事项,计划安排实验工 作时间。 2 穿白大衣准时进入实验室,保持实验室整洁安静,不得谈笑 和 大声说话,不准做与实验无关的事情。 3实验时应持“三严”作风态度严谨、思维严密、操作严格。 实验中认真、仔细观察实验过程中的实验现象和结果,及时如实的 做好原始记录。实验失败须重做。根据实验结果进行科学分析,写 好实验报告,交指导教师批阅。 4注意安全,不得擅自离开。使用易燃、易爆、有毒试剂和材料 进行实验时,应严格遵守操作规程,防止火灾、中毒、污染、触电 等事故发生,一旦发生,果断处理并立即报告教师 5 爱护公物,防止损坏,若有损坏及时报告原因并登记。公用 仪 器就原处使用,了解使用方法及遵守操作规程,使用后必须在仪器 登记本上登记并签名。公用试剂就近量取、用毕随时放回原处。要 节约水、电、煤气及试剂药品 6实验结束,洗净器材,清整实验室,打扫卫生,检查门、窗、 水、电和煤气的安全。 4 目目 录录 实验一 实验室基本知识和技术 (5) 实验二 蛋白质浓度测定(双缩脲法) (21) 实验三 醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质 (23) 附:电泳技术 (27) 实验四 血浆清蛋白的分离纯化与鉴定 (35) 附:层析技术 (37) 实验五 胰岛素及肾上腺素对血糖浓度的影响 (45) 实验六 脱氧核糖核酸(DNA)的提取及成分鉴定 (48) 实验七 质粒 DNA 提取与纯化 (51) 实验八 DNA 重组质粒的设计与构建 (54) 实验九 凝集试验 (61) 实验十 肝功能组合实验 (65) 附 1:血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定 附 2:酶联免疫吸附试验(ELISA) 5 实验十一 免疫血清的制备 (71) 实验一实验一 实验室基本知识和技术实验室基本知识和技术 (TheThe basicbasic knowledgeknowledge andand technologytechnology ofof lablab) 【目的和要求目的和要求】 1 掌握各种基本的生化技术、常用仪器的分类、使用及注意事项 2 熟悉生化实验室规则 3清点洗刷实验用具。 【实验内容】 1 实验室规则 2 生物化学实验各种基本技术 3 722 型分光光度计的使用 4 实验记录和实验报告 【仪器、设备】 1.烧杯 2.试管 3.刻度吸量管 4.离心管 5.滴管 6.搅棒 7.枪式移液器及其配适吸头 8.混匀器 9.恒温水浴箱 6 10.离心机 11722 型分光光度计,721 型分光光度计 第一部分第一部分 基本知识与操作基本知识与操作 一、常用的玻璃仪器一、常用的玻璃仪器 (一) 分类:常用的玻璃仪器分类有量器和容器, “量器”主要包括:量筒、量杯、容 量 瓶、吸管等。 “容器”主要有烧瓶、烧杯、试管、试剂瓶、离心管等。量器有量入式和量出 式两种形式。 “量入式”用“” 、 “” 、 “”表示,定量标记由下往上递增,测量注入 量器中的液体;“量出式”用“TD” 、 “A”表示;定量标记由上而下递增;测量从量器中 倾出的液体。 (二)玻璃仪器的洗涤、干燥 1、洗涤液: 洗洁精,肥皂水,洗衣粉。 玻璃仪器专用洗涤液:主要成份为中性稀氯氧化剂,上海日化研究所出品 2、洗涤的要求与步骤: 要求:要求:洁净的玻璃器皿表面应不挂任何水滴。 步骤步骤: 不净的器皿 洗衣粉或肥皂水刷洗 自来水冲净 达到要求? 是 浸入洗液(数小时至过夜) 自来水冲净 蒸馏水涮洗 23 次 (其目的是去除自来水中的杂质,故应少量多次,全面充分) 烤干或晾干、备用 注意:注意: 对使用过的仪器应养成及时清洗的习惯,特别是血液分析时用以吸取血液样本的 吸管,用过后应当立即用水将所沾的血液冲去,否则放置过久,血液干燥硬结,就很不容 易清除。 新购置的玻仪:合成洗涤剂洗刷0.2mol/L 盐酸浸泡(去除游离碱) 小时自来水冲洗冲洗次。 一般容器:如试管、烧杯、三角烧瓶等。流水冲洗合成洗涤剂洗刷自来 水多次冲洗冲洗。 容量分析仪器:如吸管、容量瓶、量筒、滴定管等。使用后立即浸泡水中。 自 来水多次冲洗沥干铬酸洗液浸泡数小时自来水多次冲洗冲洗 次。 (不能刷洗) 比色杯:用毕立即用反复冲洗。洗不净时,用盐酸冲洗,再用自来水冲洗 和蒸馏水冲洗。避免用碱液或强氧化剂清洗,切忌用试管刷或粗糙纸试擦 7 3、玻璃仪器的干燥 一般的玻璃仪器均可洗净后倒置架上,让其水分蒸发自然干燥,如需迅速干燥者应按仪 器的不同类型按下述不同方法处理: 试管、离心管、烧杯、烧瓶等普通玻璃器皿可置烤箱中 100105烘烤 少量仪器如需急用也可在电炉上或酒精灯上烘烤。烘烤时应将器皿时时转动,务使 受热缓慢且均匀,并将管口(或杯口)倾斜向下,以便水蒸气冷凝成水滴,顺口流出,不致 使水滴接触烘热了的器壁而使仪器爆裂。 使用电吹风干燥一般玻璃仪器也很便利常用。 下列玻璃仪器应避免烘烤: 各种计量玻仪:不可烘烤,自然干燥(容易造成器壁变形而致容量不准) 。常用定量吸 管很难自然干燥,可在至烘箱烤干。 厚壁玻仪(研钵、量筒比色杯:等)及结构复查的玻仪:易在烘烤时发生破裂,不可 烘烤,自然干燥。 (自然干燥适应于不急于使用和各种计量玻仪;烘烤干燥除结构复杂、厚壁及计量玻仪外, 均可。温度在,刻度吸管温度应小于。 ) 二、二、常规操作技术及注意常规操作技术及注意 (一)移液操作 用于移液操作的有奥氏吸管、移液管、刻度吸管三种吸量管及枪式移液器。 三 种 吸 量 管 比 较 奥氏吸管 移液管 刻度吸管 特点 管中有一球形膨起 管中有棱形膨出 直筒状 只有一个刻度 只有一个刻度 有多个刻度 准确度 最高 次之 再次之 应用 适用于吸取标准液 吸取标准液 生化实验中广泛使用 或粘稠性血标本 管尖液 吹 不吹 吹(完全流出式) 停留 15 秒 不吹(不完全流出式) 流速 愈慢愈好 慢流出 快流出 1、吸量管的使用 吸量管的选择: 在一次完成转移的前提下,应选用容量较小的吸量管 对于同一次实验中同一种试剂的移取,应选用同一支吸量管 操作(见图 11) 用洗耳球将液体吸至超过标线 移开洗耳球,迅速用食指压紧管口 必要时将管尖端外围拭净 调液面至标线 放开食指,使液体流入容器 将最后液滴沿器壁而下或吹出 读数(见图 12) 吸量管保持垂直 8 视线与液面应水平 管中液面与刻度线应呈切线 使用注意:持管方式;管尖插入液面的深度;吸液;读数(认刻度,准确读数,注 意无色液与有色液读数之区别) ;放液(吹与不吹之分,注:对于刻度由上至下的吸量管应 尽量使用上端刻度管尖残液是否需吹出,看清标记) 。 2、枪式定量移液器的使用 抢式移液器的结构(见图 3) (1. 液体吸放钮 2体积选取钮 3. 体积、显示 4枪 头排放钮 5. 枪头排放器 6枪头接嘴) 其内部柱塞分 2 段行程,第 1 档为吸液,第 2 档为放液,手感十分清楚。 种类: 固定式和可调式 规格: 0.510000ul 不等 操作(见图 14) 正式使用之前,要连续按动数次,使管内空气同工作环境空气交换,保持管内工 作负压恒定 调体积选取钮至所需值,在移液管下端插上塑料吸嘴,轻轻扭转以保证所密 垂直持握枪式移液器外壳,按下大拇指至第 1 档 将吸嘴垂直地浸入所需取样液内,深度为 23 毫米,徐徐松开大拇指,使之返回 原来位置。 停留 12 秒,平缓地将移液管取出,同时应避免吸嘴与任何东西碰撞。 将吸液嘴移至加样容器壁上,缓慢按动按手至第一档,将液体排了。停留 1 秒 (粘性较高的溶液停留时间可长些) 。紧接着再将按手按至第二档,排出吸嘴 里的全部液体。 (要求动作连 ) 。 完全排出液体后,小心地连同吸嘴沿着容器壁向上滑动取出。 9 再放松按手,使之返回原来位置,即完成一次操作。 如需移取另一样品,按枪头排放钮,更换枪头 注意: 移液器是精密量取,不允许将移液器直接与液体接触。 不使用时也应插上塑料吸嘴,以免液体或染色液吸入移液器内,导致阻塞。 移取过程中应控制速度,力度。 塑料吸嘴可经受 100高温高压消毒。 (二)混匀操作(二)混匀操作 (1)旋转法:手持容器,使溶液作离心旋转 (2)指弹法:一手执试管上端,另一手轻弹试管下部,:使其中液体作涡旋运动。 (3)搅动法:使用玻璃棒搅边;多用于溶解烧杯中的固体。 (4)混匀器法:将试管置于混匀器的振动盘上,逐渐用力下压,使内容物旋转。 (5)倒转混匀:适用于具塞的容器,如容量瓶、具塞量筒及具塞离心管等。操作时,将容 器反复倒转。试管内的液量太多,也可利用倒转混匀法,外面包以玻璃纸塞住管口,然后 用手指按住橡皮塞将试管反复倒转,溶液即可充分混匀。 (6)吸管混匀法:用吸管将溶液反复吸吹数次,以达到混匀的目的。 (三)加热与保温操作(三)加热与保温操作 1、加热(见图 15;图 16) 2、保温 使用恒温水浴箱,调节温度设定钮至需要的温度。 水浴箱中水要足量。 实验过程中应随时监测温度,并及时调节。 10 (四)离心操作(四)离心操作 离心沉淀法: 当颗粒小而不均一,沉淀粘稠或容积小又需精确定量时,往往采用离心沉降法。 11 1、离心前检查: 取出所有套管,起动空载的离心机,看是否转动平稳。 检查套管有无软垫,是否完好,内部有无异物。 离心管与套管是否匹配。 2、平衡: 将一对离心管放入套管,置于天平两侧,用滴管较轻一侧的离心管与套管之间加水至两 侧平衡(离心管及其内溶液量不能差别过大) 3、离心: 将等重的两管置于离心机中的对称位置,调转速调节钮,逐渐增加转速至所需值,计 时,离心结束后,将套管中的水倒净,所有套管放回离心机中。 4、使用注意 根据需要选择合适的转速、时间; 选择合适的离心管,做到对称平衡; 启动时应由低速慢慢加至所需速度 离心结束关机后,应让其自然停止,不可用手或其它物品强迫停止 (五)点收仪器 根据仪器清单,逐项查点是否完好(如有缺损向教师声明及时补充更换) 第二部分第二部分 分光光度法分光光度法 当光线通过透明溶液介质时,其幅射能量有部分被溶液吸收,一部分透过,所以光线 射出溶液介质之后光能被减少。对溶液来说,溶液呈现不同的颜色,是由于溶液中的质点 (分子或离子)选择性地吸收某种颜色的光所引起的。如果各种颜色的透过程度相同,这种 物质就是无色透明的,若只让一部分波长的光透过,其它波长的光被吸收,则溶液就呈现 出透过光的颜色,并与被吸收的光的颜色完全互补。任何一种溶液,对不同波长的光的吸 收程度是不相等的,一些有色物质可以选择性地吸收一部分可见光区的光的能量而呈现不 同颜色,一些物质却能特征性地选择吸收紫外线的能量。物质吸收由光源发出的某些波长 的光可形成特定的吸收光谱。由于物质的吸收光谱与物质的分子结构有关,而且在一定条 件下其吸收程度与该物质的浓度成正比,所以可利用物质的特定吸收光谱对其进行定性和 定量分析。分光光度法是利用各种物质所具有的这种吸收特征所建立起来的分析方法。 一、分光光度分析法的基本原理一、分光光度分析法的基本原理 劳伯比尔定律(Lambert-Beerlaw)是讨论吸收光能与溶液浓度和溶质层厚度之间 关系的基本定律,是分光分析的理论基础。 劳伯比尔定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体 12 (一)(一)Lambert 氏定律氏定律 一束单色光通过透明溶液介质时,光能被吸收一部分,被吸收光能的量与溶液介质厚 度有一定比例关系(见图 21)。表达式为 这里 I0为入射光强度 I 为通过溶液介质后的光强度 L 为溶液介质的径长(path length) k 为吸光系数(absorption coefficient)(gcm-1) (二)(二)Beer 氏定律氏定律 以溶液介质浓度变化代替溶液介质厚度的改变,光能的吸收与浓度改变有类同的关系, 即一束单色光通过溶液介质时,光能被溶液介质吸收一部分,吸收多少与溶液介质浓度有 一定的比例关系。 得出下式: 这里 C(Concentration)为溶液介质的浓度(gL-1) 将 Lambent 氏定律和 Beer 氏定律合并,即(1)和(2)合并为 式中 A(Absorbance)为吸光度 T(Transmittance)为透光度 (4)式也可表达为 A=Cb(5) 式中 (epsilon)称之摩尔吸光率(Molar absorptivity)(molL-1cm-1) C(concentration)浓度(molL) b(path length)溶液样品的长度 cm(或比色皿内径长 cm) (5)式为 lambertBeer 定律的物理表示式,其含义为一束单色光通过溶液介质后, 光能被吸收一部分,吸收多少与溶液的浓度和厚度成正比。此式为分光分析法的基本计算 13 式。 如果实验中溶液厚度 b=lcm 则 A=C 图 22 表明,在溶液介质厚度一定的情况下,吸光度(A)、透光度(T)和溶液介质浓度 (C)之间的关系。 摩尔吸光率()实际上是物质在单位浓变和单位厚度下对入射光的吸光度,在一定波 长下, 越大表示物质对光的吸收越强。 二、分光光度法的定性定量方法二、分光光度法的定性定量方法 许多对光有吸收的物质可以直接用分光光度法进行定量分析:一些对光,包括紫外、 可见或近红外都无吸收的物质亦可通过和某些化学试剂作用而呈色,在一定的反应条件下 和一定的浓度范围内,溶液颜色的深浅(对光吸收的程度)和该溶液中显色物质的浓度呈正 比。 (一)测定波长的选择 使用分光法测定溶液中物质的含量,首先要选择最适单色波长,因为只有以能被溶液 吸收的光束作为入射光才能符合 LambertBeer 定律。测定有色物质时,不同颜色的待测 溶液,则应选择不同波长的单色光束。在分光光度计上,单色光波长的选择原则一般是使 被测溶液的单位浓度的吸光度变化最大,同时还要具有最小的空白及干扰读数,借以获得 最高的灵敏度和正确性。最理想的办法是对每种物质的测定都应先傲它的光谱吸收曲线及 有关干扰物的吸收曲线,根据这些光谱吸收曲线来选择最佳测定波长。表 22 可供波长选 择的参考。 (二)分光光度法定量方法 14 1、利用标准管计算测定物含量 最适波长选定以后可进行溶液物质含量的测定。通常都采用对比测定法,即以巳知精 确含量的待测物质的溶液作为参考标准物(Cs)和未知待测样品(Cx)用同一方法,在同一条 件下、同时进行测定,读取标准物质的吸光度(As)和未知含量的样品吸光度(Ax),由于标 准物质和未知物质是同一物质,其摩尔吸光率(巨)相同和进行测定用的比色皿内径长(b)相 同即 bs=bx,根据 A=Cb 式,可得到 As=Cs 换算成下式 Ax=Cx 式中 Cs 是标准管中物质的实际含量,是标准液的浓度与实际用量的乘积;Cx 是 测定管中物质的实际含量。还应换写到法定单位 mmolL、mgm1。 2、利用标准曲线进行换算 配制一系列不同浓度的标准的溶液(至少五个)按测定管同样方法处理显色,在选定的 波长分别测定各管的吸光度(A),以吸光度为纵坐标,标准溶液的浓度(C)为横坐标,在方 格坐标纸上作图,制作标准曲线。以后在同样条件下进行测定时,测定被测溶液的吸光度, 从标准曲线上可找出相应的浓度。 根据 LambertBeer 定律,标准液的浓度在一定范围内与吸光度呈直线关系,标准曲 线是这种直线关系的描述,一般认为,标准曲线范围在测定物浓度的一半到二倍之间,并 使吸光度在 00510 范围内为宜。 还须注意:曲线制作与测定管的测定应在同一仪器上进行,由于曲线的建立与实验室 当时的条件如温度,湿度和气压及电压稳定性等有关,因此标准曲线常因各种变化而需校 正或重做。 3、摩尔吸光率 求取测定物浓度 当浓度为 1ML 时,溶液厚度为 1cm,吸光率用 表示,在已知测定物的 ,则可 根据下式求得测定物的物质浓度。 此计算法常用于紫外吸收,如核苷酸溶液含量测定,如 UTP 在 262nm 具有最大吸收 峰,利用已知 UTP 在 262nm 时的摩尔吸光率 ,读取待测 UTP 溶液吸光度 A,即可求出 该 UTP 浓度。 二种以上被测物的混合液,也可利用不同 进行定量测定。例如 a,b 两种物质在波 长 1 时,摩尔吸光率分别为 a1 和 b1:,在波长 2 时摩尔吸光率分别为 a2 和 b2,a 和 b 混合的溶液在 1 时吸光度为 Al,在 2 时的吸光度为 A2(图 23),各自浓 度分别为 Ca 和 Cb,则 如有三种以上成分的混合液,也可通过三种不同波长情况下的吸光度,以各自特有的 15 值,依据三元一次方程,同样可求出未分离的三种混合物的各自浓度- (三) 、物质的定性分析 以不同波长的单色光作为入射光,测定某一溶液的吸光度,然后以入射光的不同波长 为横轴,各相应的吸光度为纵轴作图,可得到溶液的吸收光谱曲线。吸收光谱曲线是物质 的特征性曲线,它和分子结构有严格的对应关系故可作为定性分析的依据。不同的物质, 分子结构不同,其吸收光谱曲线也有其特殊形状(图 24)。 在吸收光谱中,往往可以找到一个或几个吸收最大值,该处的波长称为最大吸收波长 (入 max)。物质不同,它们的波长(nm)最大吸收波长也往往不同,图 14 为维生素 B12 溶 液的吸收光谱曲线。 物质用分光分析定性主要依据吸收光谱存在的特征吸收。 比较吸收光谱曲线,在相同情况下,吸收光谱曲线不同,表明物质的化学结构不同, 因为不同的物质有各自的特征性曲线。如 ATP 和 GTP 都属于核苷酸,它们的溶液在紫外 光区均有吸收,但由于化学结构不很一样,它们的吸收光谱就有差别。需要注意的是在不 同条件(如选择不同溶剂)下,即使是同一物质也可呈现不同的吸收光谱。 比较最大的吸收波长。不同的物质可有不同的最大吸收波长(kmax)。如 ATP、GTP、CTP 和 UTP 的 max 分别为 259nm、253nm、271nm 和 262nm。Lnlax 可作 为物质定量测定的最适波长,此时测定灵敏度最高。有些物质化学结构相近,可产生相同 的 max,伹它们的吸收系数都不一致,可据此鉴别之。 比较吸光度比值。可根据物质两个或几个不同波长的吸光度比值来鉴别不同的物质, 同时也可检查物质的纯度。如 DNA 溶液 kmax 为 260nm。在 260nm 的吸收度和在 280nm 的吸收度比值为 18。但溶液中混进了蛋白质,则比值会降低(蛋白质在 280nm 处有最大 吸收)。 三、分光光度计基本结构与使用三、分光光度计基本结构与使用 分光光度计的类型很多,最常用的是可见分光光度计和紫外可见分光光度计。 各种类型的分光光度计的结构和原理基本相同,一般包括光源、单色器、比色杯、检 测器和显示器几大部分。 光源 单色器 狭缝 吸收杯 检测器 显示器 卤钨灯 滤光片 玻璃杯 将光信号 检流计 氢灯 棱镜 石英杯 转换为电信号 微安表 光栅 (光电管和 数字显示 16 器 光电倍增管) (一)光源 一个良好的光源要求具备发光强度高、光亮稳定、光谱范围广和使用寿命长等特点。 可见光分光光度计常用的光源是采用稳压调控的钨灯(tungsten lamp),能发射出 350nm2500nm 波长范围的连续光谱,适用于 340-900nm 范围的光源。现在常用的卤钨灯。 紫外光光度常用氢灯(hydrogen lamp)作光源,其发射波长的范围为 150nm400nm。它适用 于做 200 -360nm 的紫外分光分析。 (二)单色器 将来自光源的复合光分散为单色光的装置称为分光系统或单色器。分光光度法测定某 一物质的吸光度需要在某一特定波长下进行,单色光器的作用在于根据需要选择一定波长 范围的单色光。在实际工作中欲选择出单个某波长 的光线是困难的。所谓单色光是指在此波长有最大 发射,而在相邻较长和较短波长范围内的发射能量 较少而言。单色光的波长范围愈窄,仪器的敏感度 愈高,测量的结果愈可靠。 单色器可分为滤光片、棱镜和光栅。滤光片可 分为吸收滤光片、截止滤光片、复合滤光片和干涉 滤光片。棱镜是用玻璃或石英材料制成的一种分光 装置。其原理是利用光从一种介质进入另一种介质 时,光的波长不同在棱镜内的传播速度不同,其折 射率不同而将不同波长的光分开。见图 24 通过单色光器的发射光的强度可能过强也可能 过弱不利于进一步检测。狭缝是由一对隔板在光通 路上形成的狭缝。通过调节狭缝的大小来调节入射 单色光强度并使入射光形成平行光线,以适应检测器的需要。光电比色计的狭缝是固定的, 而光度计和分光光度计的狭缝大小是可调的。 (三)比色杯 比色杯又吸收杯,是光度测量系统的最重要部分之一。在可见光范围内测量时选用光 学玻璃吸收杯,在紫外线范围内测量时要选用石英吸收杯。比色杯的光径 0.110cm,一般 为 1cm。注意保护比色杯的质量是取得好的分析结果的重要条件之一。不得用粗糙、坚硬 物质接触吸收杯,不能用手指握取吸收杯的光学面;用后要用水及时冲洗,不得残留测定 液,尤其是蛋白质和核酸溶液。 17 (四)检测器 硒光电池、光电管或光电倍增管等光电元件常用来作为受光器,将通过比色杯的光信 号转变成电信号。进一步再用适当的方法测量所产生的电流。 (五)显示器 显示器是将光电管或光电倍增管放大的电流通过仪表显示出来的装置。常用的显示器 是有检流计、微安表、记录器和数字显示器。 四、几种常用的国产分光光度计四、几种常用的国产分光光度计 (一)721 型分光光度计 该机光谱范围在 360800nm(可见光区),该机灵敏度较高, 而且结构简单,操作方便,可用于有色物质溶液的测定。 1、721 型分光光度计光路图和外形图 19 20 2、使用方法 开启电源,指示灯亮,选择开关置于“T” ,波长调置测试用波长。仪器预热 20 分 钟。 打开试样室盖(光门自动关闭)。调节“0”旋钮,使数字显示为“000”盖上试样 室盖,将比色皿架处于蒸馏水校正位置,使光电管受光,调节透光率“100”旋钮,使数 字显示为“100.0” 。 将选择开关置于“A” 。调节消光零旋钮,使得数字显示为“000” ,然后将被测样 品移入光路,显示值即为被测样品的吸光度的值。 如果大幅度改变测试波长时,在调整“0”和“100”后稍等片刻,(因光能量变化 急剧,光电管受光后响应缓慢,需一段光响应平衡时间),当稳定后,重新调整“0”和 100即可工作。 每台仪器所配套的比色皿,不能与其它仪器上的比色皿单个调换。 换一波长测试时,应将选择开关置“T” ,重复(2)和(3)操作。 测试完毕,关闭开关,电源,将比色皿冲洗干净。 21 (三)UV754 型紫外分光光度计 1、UV754 紫外分光光度计光路图: 由光源发出的连续辐射光线,经滤光片和球面反射镜至单色器入射狭缝处聚焦成像, 光束通过入射狭缝,经平面反射镜到准直镜,产生平行光射至光栅。在光栅上色散后,又 经准直镜聚焦在出射狭缝上成一连续光谱,由出射狭缝射出定波长的单色光,通过标 准溶液再照射到光电管上。 光源切换与波长移动相对应 200nm-290nm 需点亮氘灯 290nm 一 360nm 需同时点亮氘灯和钨灯 360nm-850nm 需点亮钨灯 单色器采用自准式系统,衍射光栅使用该厂自制 1200 条nm 的复制闪跃光栅 2、测试准备 (1)打开电源开关之前,检查一下测试样品室。 (2)试样槽置“参考”位置。 (3)打开电源开关。 如果波长工作在 200nm 一 300nm 时需按氘灯触发按钮。 (4)显示器显示“754”后,数显为“1000” ,则表明仪器已通过自检程序。此时按 AC 键,仪器自动进入“0000“吸光值状态,测试“连续”及“自动”打印状态; (5)仪器预热三十分钟。 3、测试 (1)数显“0000“稳定后,即可把试样槽置于“样品”位置进行测试(即拉一下样品室 滑杆)。待第一个数据自动打印完毕后,再可将试样槽置于第二个“样品”位置测试(即再 拉一下样品室滑杆)。 (2)每当需要调换波长时,必须把试样槽置于“参考”位置,重新调零,现将测试操作 顺序如下: 注意:样品号超过 99 号,打印数复位至 00 继续计数下去。 22 (四)分光光度计和紫外分光光度计使用注意事项 光度计的光电管或光电池对不同浓度的光敏度不一样,应注意每换一次波长,即 应将空白溶液的吸光度调整到 0。 溶液定量测定,应注意吸光度在 00510 范围,浓度太大时应该适当稀释。 一般灵敏度旋钮调置“1”档,因其放大倍率最小,较稳定。 第三部分第三部分 实验记录和实验报告实验记录和实验报告 实验记录是实验结果和经验的综合记载,是分析实验结果和书写实验报告的依据。而 实验报告是全部实验的根据和总结。两者都十分重要。学生应备有实验记录本和实验报告 本 一、实验记录 1书写整洁、字迹清楚 2记录实验中观察到的实验现象、实验结果和实验数据。原始记录必须真实、客 观、 准确、祥细、清楚,切不可夹杂主观因素 3实验中使用的仪器类型、试剂规格、化学反应、分子式及浓度,都应记录清楚 4完整的实验记录应包括日期、实验项目、目的要求、操作和结果等 二、实验报告 实验结束后,应及时整理实验记录,总结实验结果,写出实验报告。实验报告应包括 以下项目: (1)实验名称 (2)目的和要求 (3)原理(简述实验的基本原理) (4)操作(可以采用流程图的方式或以表格方式表示) (5)结果与讨论 描述实验出现的现象和结果,分析它们所说明的问题,探讨实验成败 的关键。阐述对实验设计的改进意见等。对于定量实验列出算式进行计算并对实验结果进 行必要的说明和分析。 (6)思考题 实验二实验二 蛋白质浓度测定(双缩脲法)蛋白质浓度测定(双缩脲法) 【目的和要求目的和要求】 1 掌握本实验方法的原理和操作 2 掌握标准工作(AC)曲线的制作 3 熟悉蛋白质定量测定的几种常用方法 【实验内容实验内容】 1分光光度计的使用 2标准曲线的绘制 3血清蛋白质含量测定 【试剂与器材试剂与器材】 16molL 氢氧化钠溶液 称取氢氧化钠(NaOH,优级纯)240g,用新鲜蒸馏水配制成 1L, 置室温贮存在密封的聚乙烯瓶里。 23 2双缩脲试剂 称取未失结晶水的硫酸铜(CuSQ5H20)30g,溶于 500m1 新鲜蒸馏水中, 加酒石酸钾钠(NaKC4H4O6。4H2O)90g,碘化钾(KI)50g,待安全溶解后,加入 6molL 氢氧化钠溶液 100ml,最后加蒸馏水至 1L。室温贮存在密闭的聚乙烯瓶里,约稳定 6 个月。 3蛋白标准液 可用商品血清蛋白标准液或定值质控血清为标准。亦可收集混合新鲜血清, 用凯氏定氮法标定后,加叠氮钠防腐(叠氮钠的终浓度 0510gL),冰冻保存。 4恒温水浴箱、722(721)分光光度计、吸管、试管、坐标纸 【实验原理实验原理】 测定蛋白质的定量方法有很多,目前常用的有凯氏定氮法;比色法主要包括双缩脲法、 Folin-酚试剂法及 染料结合法;紫外分光光度法等 双缩脲(Biuret)法:在碱性溶液中,双缩脲(H2NCONHCONH2)与二价铜离子作 用形成紫红色的络合物,这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基( CONH2),或与此相似的基团如CH2NH2,CSNH2,C(NH)NH2的任何化合物,无 论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连,均可发生上述反应。蛋白质分子 含有众多肽键(CONH),可发生双缩脲反应,且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数 量即与蛋白质含量成正比,可用比色法测定蛋白含量。与同样处理的蛋白标准液比较,经 计算或查标准曲线即可求出血清总蛋白质含量。 【操作操作】 1.配制 20gL 蛋白标准液 如蛋白标准液浓度为 70gL,则取此液 2m1,加入新鲜蒸馏水 5ml,混匀即成。 2.按表操作 加入物(ml)空白管 12345 测定 管 20g/L 蛋白标准液 0.10.20.30.40.5 蒸馏水 0.50.40.30.20.1 0.4 待测样品液体 0.1 双缩脲试剂 3.03.03.03.03.03.03.0 相当血液蛋白质(g/L) 20406080100 混匀,置 37水浴 10min(或 2530min),用 540nm 波长比色,以空白管调零,读取各管 吸光度。 3、标准曲线绘制 15 为标准曲线管,测得吸光度后,以吸光度为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标绘制 标准曲线。 4、实验结果 24 根据测定管吸光度,从标准曲线查找相对应的总蛋白浓度。 【注意事项注意事项】 1双缩脲试剂中,加入酒石酸钾钠,Cu2+形成稳定的络合铜离子,以防止 CuSO45H20 不 稳定形成 Cu(OH)2 沉淀。酒石酸钾钠与 CuSO45H20 之比不低于 3:1,加入 KI 作为抗氧 化试剂。 2双缩脲试剂要封闭贮存防止吸收空气中的二氧化碳。 3本法各种蛋白质的显色程度基本相同,重复性好,几乎不受温度影响,唯一缺点是灵敏 度较低。 4黄疸血清严重溶血对本法有明显干扰。 5本法绘制的标准曲线是一条通过原点的直线,在 100g/L 浓度之内呈良好的线性关系。 思考题: 1双缩脲法测定蛋白质的原理是什么?其他还有什么方法测定蛋白质的含量? 2请用双缩脲法,设计一个测定蛋白质含量的定量方法(除标准曲线法外)。 实验三实验三 醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质 (Serum(Serum albuminalbumin separatedseparated byby acetateacetate filmfilm electrophoresiselectrophoresis) 【目的和要求目的和要求】 1掌握醋酸纤维素薄膜电泳的原理和操作方法 1 了解醋酸纤维素薄膜电泳所分离的血清蛋白质的各带谱及其临床意义。 【实验内容实验内容】 血清蛋白质电泳醋酸纤维薄膜法 1 仪器和薄膜的准备 2 点样 3 平衡和电泳 25 4 染色 5 结果判断 6 透明 7 定量分析 【器材】 1仪器:电泳仪、电泳槽、分光光度计或光密度仪。 2材料:醋酸纤维薄膜、培养皿、滤纸、镊子、点样器、直尺、铅笔、剪刀等。 【试剂】 1巴比妥巴比妥钠缓冲液(pH8.6,m=0.06)。称取巴比妥 2.21 克和巴比妥钠 12.36 克, 溶于 500 毫升蒸馏水中,加热溶解。待冷至室温后,再加蒸馏水稀释至 1000 毫升。 2染色液 丽春红 S 染色液:称取丽春红 S O.4g、三氯醋酸 6g,用蒸溜水溶解并稀释至 100ml。 氨基黑 10B 染色液:称取氨基黑(C22H13O12N6S3Na3)10B 0.1g,溶于 20ml 无水乙醇 中,加冰醋酸 5ml,使其溶解。另取磺基水杨酸 2.5g,溶于少量的蒸馏水中,加入前液将 两液混合摇匀,再以蒸馏水补足至 100ml。称取丽春红 S0.4 克及三氯醋酸 6 克;用蒸馏 水溶解,并稀释至 100 毫升。 3漂洗液。 (1)3(VV)醋酸溶液:适用于丽春红 S 染色的漂洗。 (2)甲醇 45ml、冰醋酸 5ml、蒸馏水 50ml 混匀,适用于氨基黑 10B 染色的漂洗。 4透明液 取无水乙醇 75 毫升和冰醋酸 25 毫升混匀备用。 5 洗脱液 (1)0.1mol/L NaOH 溶液:用于丽春红 S 染色的洗脱。 (2)0.4mol/L NaOH 溶液:用于氨基黑 10B 染色的洗脱。 640%(VV)醋酸溶液。 【实验原理】 带电荷的蛋白质,在电场中向着与其所带电荷电性相反的电极泳动称为电泳。血清中 各种蛋白质的等电点不同,但大都在 pH7 以下,若将血清置于 pH8.6 的缓冲液中,则这些 蛋白质均带负电,在电场中都向阳极移动。由于各种蛋白质在同一 pH 环境中所带负电荷多 少及分子大小不同,所以在电场中向阳极泳动速度也不同。蛋白质分子小而带电荷多者, 泳动速度快;反之,则泳动速度慢。因此可将血清蛋白质依次分为清蛋白、a1-球蛋白、 a2-球蛋白、b-球蛋白和 g 球蛋白五条区带,经染色可计算出各血清蛋白质含量的百分数。 以醋酸纤维薄膜(CAM)为支持介质,电泳分离后经染色处理,可展示出清晰的蛋白质 电泳图谱。由于染色时染料与蛋白质的结合与蛋白质的量成正比,因此将各蛋白质带剪下, 分别用一定量的 NaOH 稀溶液洗脱下来,即可进行比色,测定出各蛋白质区带的相对含量。 也可用一定量的有机溶剂使 CAM 溶解制成透明膜而用光密度计进行扫描定量。 醋酸纤维薄膜电泳具有微量、快速、简便及分辨率较高等优点,广泛应用于血清蛋白、 血红蛋白、脂蛋白、同工酶的分离和测定。 【操作】 1、电泳槽的准备 将巴比妥巴比妥钠缓冲液加入电泳槽中(两侧槽内注入等量 的缓冲液) ,调节两侧内的缓冲液,使其在同一水平面,液面与支架的距离约为 22.5cm。支架宽度到恰好适合 CAM 的长度,用 34 层滤纸或 4 层纱布搭桥。 2、CAM 准备 取醋纤薄膜(2 厘米*8 厘米)在 CAM 的无光泽面(涂有醋酸纤维素)距 一端 1.5cm 处用直尺和铅笔轻划一线(与 CAM 的长轴垂直) ,作点样标记,将膜条编号后将 无光泽面朝下浸入巴比妥巴比妥钠缓冲液中,待充分浸透后取出(一般约需求 26 2030min),夹于洁净的滤纸中,吸去多余的缓冲液. 3、点样 用血清加样器将 35ul 无溶血的新鲜血清均匀地点在划线处,样品应与 膜的边缘保持一定距离,以免电泳图谱中的蛋白区带变形。待血清渗入膜后移开点样器。 点样应注意,要适量、均匀和垂直,并避免弄破薄膜。 4、平衡 将已点样的薄膜加样面朝下,点样端置于阴极端,将膜条紧贴于电泳槽支 架的盐桥上并保持平直,桥的另一端垂入缓冲液中,盐桥将膜的两端与缓冲液连通,加上 槽盖平衡 5min 后通电电泳。 5、电泳 正确联接电泳槽与整流器对应的正负极,点样侧接负极,另一侧接正极。 开启电源通电。调节电压 10V15V/cm 膜长,电流 0.40.6mA/cm 膜总宽,电泳 4060 分 钟(通常夏季需 45min,冬季需 60min) ,待电泳区带展开 3.5cm4cm 时即可关闭电源。 6、染色 通电完毕,立即取出薄膜直接浸入丽春红 S 或氨基黑 10B 染色液中,染 色 510 分钟。 7、漂洗 至少准备 34 个漂洗皿,装入漂洗液。从染色液中取出薄膜条并尽量沥 去染色液,按顺序投入漂洗液中反复漂洗,直至背景漂白为止。此时清晰可见 5 条色带。 待干。 7、定量 (1)洗脱比色法 取六支试管,分别标明“A、1、2、空白” 。将漂洗净 的薄膜剪下各区带放入相应的试管内,另从空白背景剪一块平均大小的膜条置于空白管中, 根据染色不同按以下方法洗脱。 氨基黑 10B 染色洗脱:6 支试管于清蛋白管内加入 0.4mmol/L NaOH 溶液 6ml,其余 5 管各加 3ml,振摇数次,置 37水浴 20 分钟,使色泽完全浸出。用 620nm 波长,以空白 管调零,读取各管的吸光度,其中清蛋白管吸光度2。 丽春红 S 染色洗脱:洗脱液用 0.1mmol/L 氢氧化钠溶液,加入量同上。10 分钟后, 于清蛋白管内加入 40(VV)醋酸 0.6ml,其余 5 管各加入 0.3ml,以中和部分氢氧化 钠,使溶液色泽加深。如出现沉淀,可离心取上清液比色。用 520nm 波长,以空白管调零, 读取各管的吸光度,其中清蛋白管吸光度2。 (2)光密度扫描法 1)透明:将已漂净吹干的 CAM 条浸入透明液中 35 分钟,取出平铺于洁净干燥玻 片上(应无气泡) ,直立片刻除去过多的透明液。于 90100烘箱内烘烤 510 分钟,取 出冷却至室温。此法透明的 CAM,各蛋白区带鲜明,薄膜平整,可直接扫描或作永久保存。 若用十萘氢或液体石醋透明,应将漂洗过的薄膜烘干后进行透明,透吸后的薄膜不能久藏, 易发生皱折。 2)扫描定量:将已透明的薄膜放入全自动光密度计或其它光密度扫描的光路,选择 波长 520nm,描记各蛋白区带峰,并计算各蛋白成分的相对含量。 8、计算 定量计算时,先计算各光密度值的总和:再计算血清各部分蛋白质所占的百分率 吸光度总和(T)2A12(吸光度) Ax 血清各蛋白组分的相对百分数-100 AT Ax 表示各球蛋白组分 (2A12)的吸光度。 2A A100 100 27 T T 1 1100 100 T T 2 2100 T 各组分蛋白百分数(%)血清总蛋白 g/L 各组分蛋白质含量(g/L)- 100 9、临床意义 (1)血清蛋白醋纤薄膜电泳的正常参考值为: 蛋白质组分 g/L 占总蛋白百分比(%) 白蛋白 3552 57.068.0 1 球蛋白 1.04.0 1.05.7 2 球蛋白 4.08.0 4.911.2 球蛋白 5.010.0 7.013.0 球蛋白 6.013.0 9.818.2 (2 2)临床意义 电泳图谱可为临床疾病诊断提供依据。 肾病型可见于急慢性肾炎、肾病综合征、肾功能衰竭等,图型表现为 Alb 降低,2 和 升高;肝硬化型可见于慢性活动性肝炎、肝硬变等,图型表现为 Alb 降低, 和 增高,可出现 与 难以分离而连接在一起的“”桥,此现象是由于肝脏纤维增 生导致 IgA 增高所致;急性反应时相型常以 1、2增高为特征;慢性炎症型则以 Alb 降 低,2、 增高较为常见;M 蛋白血症主要见于多发性骨髓瘤,病人有大量单克隆蛋白质 (主要是 IgG 或 IgA) ,电泳时可在 和 之间出现一条峰形狭窄的区带,称 M 区带。 【注意事项注意事项】 1通电时,不得接触槽内的缓冲液或 CAM,以防触电。 2每次电泳时应交换电极以使两侧电泳槽内缓冲液的正负离子相互交换,以使缓 冲液的 PH 维持在一定水平。 3电泳缓冲液的液面要保持一定的高度,过低可能会出现 球蛋白的电渗现象( 球 蛋白向阴极移动) ,同时电泳槽两侧的液面应保持在同一水平,否则,通过薄膜时有虹吸现 象,将会影响蛋白质分子的泳动速度。 4电泳失败或图谱不理想的常见原因 (1)电泳图谱不整齐或蛋白各组分分不佳:点样过多;点样不均匀、不整齐;薄膜过 湿,样品扩散;点样速度太慢,薄膜表面局部干燥或薄膜未完全浸透或温度过高致使膜面 局部干燥或水分蒸发;缓冲液变质;电泳时薄膜放置不正,歪斜、弯曲,与电流方向不平 行;样品不新鲜;电流过低;CAM 质量不好,薄膜结构过分细密,透水性差,导电差等。 (2)染色后白蛋白中间着色浅:染色时间不够或染色液陈旧;白蛋白含量过高,可减 少血清用量或延长染色时间。 (3)电泳速度慢:电流过低;供给薄膜的缓冲液不足,连接薄膜与缓冲液的滤纸或纱 布过薄;温度过低;薄膜结构过分细密,透水性差,导电差;缓冲液水分蒸发,致使离子 强度增大。 28 (4)薄膜透明不完全:透明液陈旧;浸泡时间不足;烘箱温度未到 90即把薄膜放 入。 5染料问题:各种染料对血清各组分有不同的亲和力,大多数染料对白蛋白的亲和力大 于球蛋白。如氨基黑 10B 对球蛋白的结合力为白蛋白的 80,因此常导致白蛋白结果偏高, 球蛋白偏低。用丽春红 S 染色,效果优于氨基黑 10B。丽红是一种指示剂,PH10 时呈
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