树突状细胞免疫反应北京肿瘤医院guoju.doc

摘要 树突状细胞由于能够刺激并致敏初始T细胞和启动早期免疫反应而被公认为是最具有潜能的抗原提呈细胞。树突状细胞疫苗的抗肿瘤免疫治疗效果在动物模型中得到了验证，同时人树突状细胞培养的方法也得到了进一步的改进和完善。因而，树突状细胞疫苗的抗肿瘤免疫治疗得以进入I-II期临床研究。本文就近年来应用树突状细胞疫苗进行抗肿瘤免疫治疗的临床研究中，树突状细胞的获取和培养、树突状细胞的注射途径和剂量、目前临床应用治疗的肿瘤类型和方法以及治疗的疗效及评价指标进行了综述。免疫治疗目前在多数肿瘤治疗中，只起辅助治疗的作用，其原因是一方面真正实用的肿瘤抗原十分有限；另一方面是由于多种因素的影响，这些肿瘤相关抗原免疫原性低，难以完成抗原的有效提呈。近年来随着树突状细胞（dendritic cells ,DC）的深入研究，为我们提供了产生更有效的抗肿瘤免疫的理论基础。体内DC数量很少，但却是唯一有能力呈递蛋白质抗原并致敏初始T细胞的APC。研究证实，DC不仅能够以抗原特异的形式启动T细胞是被和杀伤肿瘤细胞（1），而且还可以激发免疫记忆保护，在宿主再次受到肿瘤细胞攻击时发挥保护作用（2）。因此，通过应用DC能够使肿瘤细胞免疫治疗更为有效。 1. DC的生物学特性成熟DC形状特殊，其细胞膜有较强的伸缩能力，甚至可扩展到数百微米，扩展的形式有：树突、伪足、面纱等。DC另一特点就是其表面存在大量MHC II类抗原，同时缺乏子系标志（3），如DC14（单核细胞），CD3（T细胞），CD19，CD20，CD24(B细胞)，CD56（NK细胞），CD66b（中性粒细胞）。DC还表达多种黏附分子（4），如：CD11a（LFA21），CD11c，CD50(ICAM22)，CD54(ICAM21)，CD58(LFA23)和CD102（ICAM23），以及共刺激分子如CD80（B721）和CD86（B722）等。DC在成熟和激活的不同阶段，其表型也发生着变化。人体血循环中DC的前体表达CD2，CD4，CD16，CD32和CD33，当其成熟时，这些分子的表达就会逐渐降低。而另一方面，黏附分子、共刺激分子和MHC抗原表达则明显上调。DC的前体骨髓迁移至血液系统，并随血液循环迁移至体内特殊部位，在这些部位内成熟并发挥免疫监视功能。这种向组织内的迁移依靠DC表达趋化因子受体CCR1，CCR5和CCR6等来完成。组织定居的DC，包括皮肤内的郎罕氏细胞以及肝脏、粘膜以及肺中的DC，对抗原进行加工并将其与MHC I类和II类分子形成复合物共同呈递。DC还需要抗原非依赖性信号激活并俘获抗原。这些信号包括LPS，IFN2，IFN2，IL21和来自病毒及细菌的直接刺激。被激活后，DC下调抗原摄取和加工的能力，上调MHC、共同刺激分子、黏附分子表达和呈递抗原能力。激活的DC将离开组织，通过输入淋巴管迁移至T细胞富集的引流淋巴结内。这个过程主要由DC上调CCR7 受体的表达、并受CCR7的配体MIP3和SLC 这2种趋化因子而实现。到达二级淋巴器官后激活的DC可分泌趋化因子和细胞因子从而发挥DC独特的机能。另外，实验发现DC还能向NK细胞呈递抗原，为DC启动有效的免疫反应提供另一种方式（5）。2DC的获取及培养近年来，随着对DC的起源、分类标志、摄取及加工处理抗原的机制以及引起DC迁移和成熟的信号传导等领域的认识进一步加深，体外培养获取大量DC用于临床的研究方法日趋成熟。首先，DC可以由CD34+细胞产生，存在于人骨髓、脐血、和成年人外周血中的CD34+细胞，体外在添加GM2CSF和TNF2的培养条件下可以发育成DC。另外，DC也可以由CD14+ 细胞产生。CD14+单核细胞在添加GM2CSF和IL24的条件下也可以分化为成熟的DC。研究证实了这些途径来源的DC是生物学功能完好的DC，与纯化的体内成熟的DC比较具有同样的APC功能（6），因而，可较好地应用于临床抗肿瘤免疫治疗研究。临床研究大多采用外周血CD14+单核细胞来源的DC，主要因为这种方法取材方便、培养容易。由于临床实验设计标准不同，现在尚难比较上述2种来源DC的疗效。实验发现，在激活混合淋巴细胞反应（MLR）和摄取抗原能力上，鼠骨髓来源的DC比脾脏来源的DC强、成年人外周血DC较脐血DC强（7）。目前临床上应用的DC大都来源于患者外周血，DC经体外培养致敏后，回输患者体内进行抗肿瘤免疫治疗。Kugler_等（8）用正常的同种异体捐献者外周血CD14+单核细胞来源的DC作为疫苗，将经照射的自体肿瘤细胞和同种异体DC（1*108（1乘10的8次方）细胞/例，其中10%-15%为融合体）皮下注射治疗原发性肾癌，获得了较为理想的疗效。这说明同种异体来源的DC在DC疫苗的抗肿瘤治疗中也有着广阔的发展前景。3DC的输注途径和剂量3.1输注途径早期DC的输注途径多采用静脉注射。近年来，采用皮下、皮内、淋巴管内、瘤体内注射的方法得到广泛的应用。目前，多数学者认为，皮内、瘤体内注射可能更有利于DC发挥其生物学功能。DC发挥其抗肿瘤免疫效应的基础是DC负载肿瘤抗原后，能够迁移至T淋巴细胞富集的二级淋巴器官，从而激活抗肿瘤免疫反应。因此，DC的输注途径与其能否更好地发挥生物学功能密切相关。3.1.1静脉及淋巴管内注射Mackensen 等（9）对DC的静脉及淋巴管内注射进行比较，作者用转移恶性黑色素瘤患者外周血CD34+造血干细胞来源的DC经放射性标记后，静脉或淋巴管内注射，照相机全身拍照观察。发现DC经静脉注射后在肺内作短暂停留，最后定位于脾脏和肝脏7d以上；DC注入足背淋巴管内后，可迅速迁移至引流淋巴结并停留24h以上，实验说明淋巴管内注射与静脉注射相比，更有利于DC发挥其抗肿瘤作用。3.1.2 真皮内注射Thomas等（10）则比较多种DC的输注形式后，发现真皮内注射DC后，10 min内就可见标记的DC迁移入引流淋巴结，4h后引流淋巴结显像最明显，证实真皮内注射可以使DC快速迁移至引流淋巴结且可以滞留较长时间，说明真皮内注射可能是DC疫苗抗肿瘤治疗的另一较佳输注途径。3.1.3 瘤体内注射目前，DC疫苗抗肿瘤治疗临床实验，大都采用肿瘤细胞抗原肽、肿瘤细胞溶解物或凋亡的肿瘤细胞先体外致敏DC，然后回输体内。然而，体外致敏存在明显不足，如DC体外培养时间较长，致敏过程繁琐，增加了DC被污染的机会。另外，肿瘤抗原的局限性和非特异性也是潜在地导致DC疫苗不能较好地发挥其抗肿瘤免疫效应的因素。因此，将DC直接注射入瘤体内，使其体内致敏，无疑是一条较好的思路。肿瘤组织内浸润DC 的数量与肿瘤患者的预后呈正相关。Triozzi 等（11）取已有远处转移的7例恶性黑色素瘤、3例乳腺癌患者自体外周血单核细胞来源的DC，培养后直接将3*108（3乘10的8次方）DC多点位注射于瘤体内。4d后，4例恶性黑色素瘤和2例乳腺癌患者的肿瘤即开始退缩。退缩肿瘤组织活检发现瘤体内大量淋巴细胞和DC浸润。3.2剂量大部分临床报道DC每次注射的细胞数量为106-108（1乘10的6次方-1乘10的8次方）。研究认为DC注射的细胞数量与肿瘤缓解的时间成正比。如Small 等（12）报道，前列腺癌激素治疗无效的患者，用前列腺酸磷酸酯酶（PAP）和GM2CSF融合蛋白作为抗原致敏外周血来源DC后，以不同的细胞数量静脉回输，结果6例患者均诱导出了抗肿瘤免疫反应，其中3例患者前列腺特异性抗原（PSA）水平下降了50%。疾病的缓解时间和获得的对PAP 的免疫反应的持续时间与接受的DC注射细胞数量呈正相关。但是否细胞数量越高，治疗效果越好，又无平台效应，细胞数量多少为最佳尚需进一步研究。4.DC疫苗治疗的肿瘤类型应用DC疫苗治疗恶性肿瘤的尝试，目前已在恶性黑色素瘤、前列腺癌、乳腺和卵巢癌、肺癌、结直肠癌等患者中进行了研究并取得了部分成功。4.1 恶性淋巴瘤首次报道以DC为基础的临床免疫治疗就是应用抗瘤特异性抗原致敏自体来源的DC来治疗传统化疗失败的恶性B细胞淋巴瘤患者（13）。先将患者肿瘤特异性免疫球蛋白经体细胞融合技术由杂交瘤上清纯化出来，再用患者外周血淋巴细胞分离的DC与肿瘤特异性免疫球蛋白共同孵育，经静脉回输患者体内。结果治疗的4例患者均产生了可检测到的抗肿瘤免疫反应，2 例CR，1例PR，未出现明显地毒副反应。到目前为止，应用DC免疫治疗恶性淋巴瘤已经得到了广泛研究，但由于采用的方法不同，疗效有较大的差异，但所有的结果均显示，DC疫苗在治疗恶性淋巴瘤方面存在着巨大的潜力。4.2 前列腺癌应用DC 疫苗治疗进展期前列腺癌已有不少成功报道。Murphy等（14）对51例激素治疗无效的前列腺癌患者进行了自体DC和2种HLA2A2限制性前列腺特异性抗原（PSMA）多肽治疗。6*106（6乘10的6次方）单核细胞来源的DC和高亲和力的PSMA多肽一同每周静脉注射1次共6次。30%出现PR，无明显毒副作用。另一较大的临床试验，应用2*107（2乘10的7次方）DC与PSAM来源的多肽治疗进展期前列腺癌，每月注射1次，共6次，结果33例患者中25%-30%获得了CR。4.3 恶性黑色素瘤应用DC疫苗治疗恶性黑色素瘤的研究已有较多的报道。治疗多采用一系列的恶性黑色素瘤来源的HLA限制性多肽致敏外周血单核细胞来源的DC。如Nestle等（15）将临床实验限制在那些表达HLAA1 及A2 等位基因的恶性黑色素瘤的患者，15例患者中有5例获得CR。Lotse等（16）也报道了在他们的类似的恶性黑色素瘤的临床试验中，6例患者中有1例获得CR。4.4多发性骨髓瘤DC疫苗治疗多发性骨髓瘤的报道虽然不多，但显示了一定的治疗潜力。如Liso等（17）对多发性骨髓瘤患者经大剂量化疗和干细胞移植后，每月进行2次DC静脉注射，此DC为自体来源的经骨髓瘤独特型抗原或与匙孔血兰蛋白（KLH）偶联的骨髓瘤独特性抗原致敏。26例患者中24例产生了KLH特异的免疫反应，4例患者产生了独特性抗原特异的免疫反应。这4例患者中3例获得CR，跟踪的17名患者中生存期达30个月。4.5乳腺和卵巢癌 DC疫苗治疗乳腺和卵巢癌的研究获得了较好的疗效。如Brossart等（18）研究了进展期乳腺和卵巢癌患者共10例。用自体来源的DC经HER22/neu 或MUC1来源多肽致敏作为疫苗，其中5例诱导出明显的特异性细胞毒性T淋巴细胞反应，且可持续6个月余。有趣的是经过几次免疫注射后，经过MUC1多肽致敏的DC可诱导出对CEA，MAGE23 特异的CTL反应，说明在乳腺和卵巢癌患者体内，用单一抗原致敏的DC的诱导对多种其它肿瘤抗原的免疫反应。4.6恶性脑神经胶质瘤DC疫苗治疗恶性脑神经胶质瘤的尝试也取得了好的效果。如Yu等（19）报道恶性脑神经胶质瘤患者外周血来源的DC，经自体来源的神经胶质瘤细胞洗脱抗原冲击后，每隔2周皮下注射，共3次。7例患者中4例诱导出特异性CTL反应。后此4例患者肿瘤经手术切除，病理证实有2例瘤体内有较多的细胞毒性T细胞和记忆型T细胞浸润。说明DC疫苗治疗恶性脑神经胶质瘤安全可行且有效。4.7肾癌应用DC疫苗治疗肾癌的研究取得了较为理想的疗效。如Kugler等（8）对17例进展期肾癌患者用DC融合疫苗进行治疗，结果7例患者观察到了明显的治疗效果，其中4例CR，2例PR，其中2例严重肺转移的患者稳定时间达17-19个月，4例CR中的3例仅2次注射后所有的转移灶消失，21个月后仍未观察到肿瘤复发。5 DC与细胞因子或佐剂联用由于在肿瘤环境中存在着免疫抑制，因此将DC与共刺激分子、细胞因子、促有丝分裂原及细菌性抗原一起联用，有助于克服免疫抑制状态，增强DC的功能。近来发现FLt3L可通过提高DC的数量而促进DC的抗肿瘤作用，Morse等（20）应用FLt3L治疗转移性结肠癌患者，发现FLt3L能够将DC动员至外周血并提高DC在瘤周的浸润。且FLt3L促进的DC动员与迟发性超敏反应的增高呈正相关，说明FLt3L能提高血循环中DC的数量并可能成为DC抗肿瘤免疫治疗中有用的佐剂之一。细胞因子与DC疫苗联用也获得了较好的效果。Okada等（21）用照射后的自体来源的恶性神经胶质瘤作为抗原致敏DC后，于传染IL24的成纤维细胞共同使用，结果产生了明显的协同效应，大大提高了DC诱导的抗肿瘤免疫反应。Panelli等（22）用MART21 或PG100冲击的自体单核细胞来源的DC与IL22共同使用，7例恶性黑色素瘤患者中1例恶性黑色素瘤皮肤和肺部转移灶出现部分退缩。Simmons等（23）讨论了患者经GM2CSF治疗后是否促进了抗原致敏的DC诱导的抗肿瘤免疫反应。结果发现44例DC疫苗治疗前接受GM2CSF治疗的患者，1例CR，8例PR，而未接受GM2CSF的51例患者2例CR，17例PR，说明GM2CSF作为佐剂对DC 疫苗的抗肿瘤免疫反应无明显促进作用。用细菌或病毒抗原与DC疫苗联用也能促进DC 的抗肿瘤作用。如将MAGE23A2.1恶性黑色素瘤与流感Ma2trixA2 多肽共同致敏单核细胞来源的DC，6*106（6乘10的6次方）皮下注射，6*106（6乘10的6次方）及12*106（12乘10的6次方）静脉注射治疗恶性黑色素瘤患者，结果所有8例患者均产生了恶性黑色素瘤抗原特异的、能分泌IFN的效应CD8+T细胞（24）。6.肿瘤细胞于DC融合疫苗的临床研究利用细胞融合技术可使肿瘤细胞与DC融合成一个异种杂合体，这种杂合细胞既能表达肿瘤抗原又能发挥DC的共刺激能力（25），且避免了繁杂的肿瘤特异性抗原鉴定工作。动物实验和体外试验已证明，肿瘤细胞2DC融合产物是诱导T细胞介导的抗肿瘤免疫的有效细胞疫苗。如Gong等（26）将人乳腺细胞MCF27与穿异性乳腺癌病人CD14+ 来源的DC常规法融合，证实融合细胞能够引起自身T细胞增殖，且发现此融合细胞能以MHC I 限制方式杀伤自身肿瘤细胞。临床应用患者自身肿瘤细胞与同种异体DC融合疫苗，同样取得了令人瞩目的治疗效果。如Kugler等(8)用肾癌患者自身肿瘤细胞和同种异体DC融合疫苗对17例患者进行了治疗，结果7例患者对这种杂合疫苗产生反应，其中4例CR，2例PR，此外，有2例严重肺转移的患者稳定时间达17-19个月，4例CR中的3例仅2次注射后所有的转移灶消失，21个月后仍未观察到肿瘤复发。这表明杂合疫苗在治疗人类转移性肾癌中安全且有良好的发展前景。虽然自身肿瘤细胞的获取有一定困难，但此方案仍然为肿瘤患者的个体免疫治疗提供了一个较好的范例。目前，欧洲的多个国家已经开始实施这一治疗方案，其治疗效果尚待长期观察。7 评价DC疫苗特异性免疫效果的指标在临床研究中，DC疫苗是否激发了抗肿瘤免疫反应，除了临床指标观察肿瘤缓解情况外，近来的报道也为我们提供了新的监测指标和方法。如Lodge等（27）报道用外周血单核细胞来源的DC，经前列腺特异的膜抗原PSM2P1和PSM2P2冲击后治疗前列腺癌，证实DC疫苗的临床治疗反应与以下2个指征密切相关：1）用致敏DC所用的特异性抗原进行皮试反应；2) 非特异性刺激后T细胞细胞因子的分泌。Rieser等（28）用KLH作为免疫示踪分子来确定DC疫苗诱导的体液免疫和细胞免疫的程度。将进展期肾癌患者为周血来源的DC，用自体来源的肿瘤裂解物和KLH致敏，对患者进行治疗，证实KLH可作为DC疫苗诱导的体液免疫和细胞免疫的程度的检测指标。实验也证实延迟型超敏反应（DTH）参与的Th1型免疫反应是DC诱导抗肿瘤免疫反应所必需的。能否诱导抗原特异性免疫反应也是