生化实验.doc

1什么是生化研究技术？生物化学研究技术是指用物理学、化学和生物学的现代技术来研究生命物质的化学组成、结构及生命过程中各种化学变化的科学。研究内容主要为生物体的化学组成 新陈代谢与代谢调节控制 生物大分子的结构与功能 酶学研究 生物膜和生物力能学 激素与维生素 生命起源 方法学等。2 生化研究技术中，常用的层析方法有哪些？答：一、吸附层析1、吸附柱层析2、薄层层析3、聚酰胺薄膜层析 二、离子交换层析 三、凝胶过滤 四、亲和层析 五、聚焦层析 3 常用的电泳方法有哪些?答： 一、纸电泳法二、醋酸纤维素薄膜电泳法三、琼脂糖凝胶电泳法四、聚丙烯酰胺凝胶电泳法五、SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳法4 测定蛋白质分子量的方法有哪些？凝胶电泳、分子筛过滤、盐析沉淀、质心法、沉降法（超速离心法）5 如何提纯一种蛋白质？（一）材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有：1. 机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。3. 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。(二) 蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法：1. 等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。2. 盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。3. 有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。（四）样品的进一步分离纯化用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。6 SDS-PAGE结果不满意或失败的原因有哪些？一、SDS与蛋白质的结合按质量成比例（即：1.4gSDS/g蛋白质），蛋白质含量不可以超标，否则SDS结合量不足。二、用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时，必须同时作标准曲线。不能利用这次的标准曲线作为下次用。并且SDS-PAGE测定分子量有10误差，不可完全信任。三、有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在巯基乙醇和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链的相对分子量。四、有的蛋白质（如：电荷异常或结构异常的蛋白质；带有较大辅基的蛋白质）不能采用该法测相对分子量。五、如果该电泳中出现拖尾、染色带的背景不清晰等现象，可能是SDS不纯引起。7 做酶的相关实验要考虑和注意的事项有那些？盐析法分离纯化POD及活力测定:一、硫酸铵盐析的注意事项：（1）所用硫酸铵的纯度要高，这一点对酶尤为重要；（1）分离几种酶时，可采用分段盐析法，盐的饱和度由低到高增加，加入硫酸铵时，要少量多次，尽量避免局部浓度过大，要让硫酸铵充分溶解。至少放置30min后才进行离心操作。（1）要严格控制温度和pH（1）蛋白质的浓度不能过高，一般在2.5%3%为宜，太高易产生沉淀。（1）盐析得到的酶一般需要脱盐，才能获得纯品或进行层析操作进一步纯化。二、有机溶剂分级沉淀法的注意事项：（1）有机溶剂沉淀是个放热过程，一般应在0度左右一度进行，溶剂应预冷，加入时要边搅边滴，以免局部浓度过高，使酶变形；（1）溶剂的pH最好控制在被分离酶的等电点附近，以提高分离效果；（1）酶的浓度应控制在5-20mg/ml范围内，过高易产生共沉淀，过低易变性，可加入甘氨酸等介电常数大的物质避免；（1）有机溶剂在中性盐存在时可减少蛋白质变性，增加蛋白的溶解度，提高分离效果，但过高会使蛋白过度析出。一般盐浓度为0.005mol/L左右，离子浓度应控制在0.05-0.1范围内。离子交换层析分离纯化SOD以及活力测定:（1）植物中的酚类可使SOD失活，加入PVPP等可出去酚类。（2）SOD测活时，NBT的光还原与光照强度和时间有关，应严格控制。（3）侧活力加入的酶量，亦能抑制反应的50%为佳。（4）选择合适的交换剂是离子交换层析分离大分子能否成功的关键之一。（5）离子交换剂的预处理十分重要，尤其是使用过的离子交换机。（6）加样时应注意a 样品应用起始缓冲液平衡 b缓冲液的选择应根据被分离物的等电点、稳定性和溶解度及交换剂解离集团的pK值进行选择 c 加样量取决于实验所要获取组分的性质、浓度及其对交换机的亲和力而定。（7） 洗脱是离子交换层析中至关重要的一步。多用梯度层析。需注意：a 梯度上限要高，使得吸附紧的、且又是欲获得的组分能被洗脱下来。 b 梯度的斜度要足够平缓，以保证各组分得以分开。但又要足够陡峭，以免峰形扩宽或拖尾。 C 洗脱液总体积要足够大，使分离峰不致太靠近，一般为床体积的5-10倍。8生化技术中常用的浓缩方法有哪些？吸附法：对于抗生素等小分子物质可用吸附法，现在常用的吸附剂为大网格聚合物，另外还可用活性炭、白土、氧化铝、树脂等。离子交换法：极性化合物则可用离子交换法提取，该法亦可用于精制。沉淀法：沉淀法广泛用于蛋白质提取中，主要起浓缩作用，常用盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀和非离子型聚合物沉淀等方法。沉淀法也用于一些小分子物质的提取。萃取法：萃取法是提取过程中的一种重要方法，包括溶剂萃取、两水相萃取、超临界流体萃取、逆胶束萃取等方法，其中溶剂萃取法仅用于抗生素等小分子生物物质而不能用于蛋白质的提取，而两水相萃取法则仅适用于蛋白质的提取，小分子物质不适用。超滤法：超滤法是利用一定截断分了量的超滤膜进行溶质的分离或浓缩，可用于小分子提取中去除大分子杂质和大分子提取中的脱盐浓缩等。9 哪些方法可以用于脱盐？常用方法是透析法和凝胶过滤法透析脱盐：通过小分子经过半透膜扩散到水（或缓冲液）的原理，将小分子与生物大分子分开的一种分离纯化技术。凝胶过滤法：凝胶过滤法又称分子排阻法， 这是一种高效分离纯化蛋白质的方法。原理是不同的蛋白质分子对固定化在载体上的特殊配基具有不同的识别和结合能力。选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作用的配基，然后应用化学方法将该配基与载体共价链接。将这种有配基的载体装入层析柱中，当含有待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋白质即与配基发生特异性结合而被吸附在层析柱上，而其他蛋白质则流出柱外。被特异性结合在层析柱上的蛋白质，可以用适当的配体洗脱液洗脱。凝胶有：葡萄糖凝胶、琼脂凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、Sephacry1、Superdex10 亲和介质如何再生？当洗脱结束后，应连续用大量的洗脱液或高浓度的盐溶液彻底洗脱柱子，接着再用平衡缓冲液使柱层析重新平衡。经过这样处理的柱子可以再次上样，进行第二次亲和层析。一般亲和层析柱都可以反复使用多次。11 操作和应用方面，亲和层析与凝胶层析有何异同？凝胶过滤操作1凝胶的选择 根据层析物质分子量的大小选择不同型号的凝胶，如除盐和除游离的荧光素，则可选用粗、中粒度的G28或G500，G250多用于分离蛋白质单体，G200多用于分离蛋白质凝胶聚合体等。2凝胶的预处理 称取适量的凝胶加入过量的缓冲液在冰箱（或室温）中充分膨胀，或在沸水中煮，膨胀时间应根据不同型号的凝胶而定。 为使粒子均匀一致需进行浮选，即加入凝胶粒子后，轻轻搅拌，静置20min，倾去沉淀的粒子，如此反复数次即可。3装柱 层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的25100倍。去盐、游离荧光素约为样品体积的410倍。柱太短，影响分离效果。柱长一些，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，样品也稀释过度。层析柱的内径也要选择适当。内径过细，会发生“器壁效应”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。对于除盐来说应为15125；对于纯化蛋白质来说应为1201100。 装柱过程基本同离子交换层析柱。4加样与洗脱 样品体积不宜过多，最好为床体积的15%，最多不要超过10%。样品浓度也不宜过大，浓度过大粘度大，分离效果差，一般不超过4%。 洗脱液应与膨胀一致，否则更换溶剂，凝胶体积会发生变化，影响分离效果。洗脱液要有一定的离子强度和pH值。分离血清蛋白常用0.020.1Mol/L pH 6.98.0的PBS液（0.14Mol/L NaCl）和0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl缓冲盐溶液（0.14Mol/L NaCl）。5洗脱液收集 同离子交换层析。6凝胶柱的重复使用与保存 当样品的各组分全部洗脱下来之后，即可加入新的样品，继续使用。亲和层析操作方法重点：载体的基本要求和选择步骤：1. 琼脂糖活化 取20ml Sepharose 4B放在布氏漏斗中抽干，加少量的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液洗涤，立即转入100ml烧杯中，冰浴置于磁力搅拌器上。 在通风橱内称取2g溴化氰，加水20ml溶解，然后倒入琼脂糖中，小心滴加2Mol/L NaOH,使pH保持在11左右，反应10min。在1min2min迅速调整pH为8.011.0维持10min。 将活化的琼脂糖迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗成中性，再迅速以250ml冷的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3抽洗。2偶联蛋白 20ml 4B液体相当于一半的固相载体。 事先将需偶联的抗原（或抗体）蛋白200mg置于0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液中透析数小时(一般偶联量为1030mg/g载体)。 将活化的琼脂糖迅速倒入蛋白液中（在1.5min内，从抽洗到偶联），4缓慢搅拌过夜，使蛋白与活化的琼脂结合。3装柱 选柱：不宜过大，一般以1.515cm的层析柱可装偶联蛋白的琼脂糖约30ml。 装柱：将已与蛋白偶联的琼脂糖装入层析柱内，拧紧下口夹，让其下沉，数分钟后松开下口夹，使溶液约以1ml/min的速度流出。 洗柱：以0.2Mol/L pH 9.0 NaHCO3（含0.1Mol/L NaCl）洗涤至洗出液的OD2800.02为止。收集全部的洗脱液，测得的OD280值洗脱液的总ml数即为未偶联蛋白的含量，由此可计算偶联率。4吸附与解吸附按床体积1/10加样，浓度为12%，缓慢加入待纯化的抗体（或抗原），用0.01Mol/L pH7.4PBS液洗脱，流速为1ml/min，至洗出液OD2800.02为止。加0.1Mol/L pH2.4甘氨酸HCl缓冲液，流速1ml/min，收集解吸附下来的成分，立即以1Mol/L NaHCO3中和，以免蛋白变性。5以两倍体积的7Mol/L尿素洗涤，再用0.01Mol/L pH 7.4PB液或生理盐水洗涤，平衡后，可继续使用。保存可加入0.02%Na N3于4保存。防止冷冻和干裂。6结果判定 对解吸附下来的蛋白以圆盘电泳或双相琼脂糖电泳进行纯度鉴定。 将纯度好的各管洗脱液合并，以生理盐水透析，然后浓缩或冻干保存。总结：亲和层析由于是配体与待分离物质进行特异性结合，所以分离提纯的效率极高，可提高纯度几千倍，是当前最为理想的提纯和浓缩方法。亲和层析的配体与待分离物质特异性结合性质还可用来从变性的样品中提取出其中未变性的部分，从大量污染的物质中提纯小量所需成分，亲和层析还可用来从极度稀薄的液体中浓缩其溶质。 亲和层析所用的载体和凝胶过滤所要求的凝胶特性相同，即化学性质稳定，不带电荷，吸附能力弱，网状疏松，机械强度好，不易变形，能保障流速的物质。聚丙烯酰胺凝胶颗粒、葡聚糖凝胶颗粒以及琼脂糖凝胶颗粒都可用，其中以琼脂糖凝胶(Sepharose 4B)型应用最广泛。亲和层析的关键是设法选择合适的配体，并将此配体与载体以化学方法连接起来，形成稳定的共价键，这需要在实际工作中根据需要加以选择和试验。应用差异：凝胶过滤：脱盐和浓缩、分离生命物质、去热源物质、测定分子质量、其他（在葡萄糖凝胶分子上分别连接DEAE、羟甲基或磺酸乙基等离子基团是，可使其不仅具有分子筛效应，而且具有离子交换的能力。亲和层析：纯化大分子物质、研究酶的结构与功能12 亲和技术的原理是什么？离心操作时最重要且最易忽略的是什么？亲和技术的原理：和层析是应用生物高分子与配基可逆结合的原理，将配基通过共价键牢固结合于载体上而制得的层析系统。这种可逆结合的作用主要是靠生物高分子对它的配基的空间结构的识别。常用的生物亲和关系有酶-底物、底物类似物、抑制剂、激活剂、辅因子，抗体-抗原，激素-受体蛋白、载体蛋白，外源凝集素-多糖、糖蛋白、细胞表面受体，核酸-互补核苷酸序列、组蛋白、核酸结合蛋白等。离心操作要点：1、打开离心机电源开关，进入待机状态。 2、选择合适的转头，心时离心管所盛液体不能超过总容量的2/3，否则液体易于溢出；使用前后应注意转头内有无漏出液体残余，应使之保持干燥。3、离心管平衡误差应在0.1克以内。 4、选择好离心参数5、将平衡好的离心管对称放入转头内。盖好转头盖子拧