外周血染色体制备及分析.doc

外周血染色体制备及分析原理：人体外周血淋巴细胞在植物凝集素(PHA)的刺激下，能转变为具有分裂能力的母细胞。外周血细胞经过含有PHA的培养液培养72小时后，再经过秋水仙素的处理，低渗和固定就可获得大量有丝分裂细胞，用空气干燥法制片，胰酶处理，吉姆萨染料显带，便能制备供显微镜分析的染色体标本。由于整个培养过程操作比较繁琐，许多操作步骤对结果都有非常重要的影响，比如接种的血量，培养基的质量，培养的时间和温度，秋水仙素加入的时间和浓度、低渗的时间，预固定、固定的时间以至制片时的温度和湿度等.本实验室经过长期的实践和总结，对培养的每个步骤都实行严格的标准化操作，取得良好的效果，具体方法如下：一、试剂准备1、0.2%的肝素溶液2、0.0005%秋水酰胺溶液（黑色纸包裹避光置4冰箱保存）3、0.075mol/Ll氯化钾溶液4、3：1甲醇冰醋酸溶液（固定液，临用前配制）5、10%Giemsa染色液（将Giemsa原液临用前用PH7.4的磷酸缓冲液即PBS新鲜配制）二、采血与培养 取外周血淋巴细胞培养基(RPMI1640)室温复融，并标记姓名、编号，每例标本接种2瓶，肝素湿润的无菌注射器采取静脉血1-2ml，于每瓶接种0.3-0.5ml。置37培养箱内培养72小时。每日早晚定时摇匀培养物1次。收获细胞前2小时，用5号针头加入10ug/ml秋水仙素2-3滴，（培养基中秋水仙素的最终浓度为0.1ug/ml左右）。摇匀后继续培养2小时。三、收获细胞 培养箱中取出培养瓶：将培养的细胞移入10ml刻度离心管中，标记姓名、编号，以1000转/分钟，离心10分钟后弃上清。 1低渗处理：向离心管中加入6-8ml事先预温（37）的0.075mol/L Kcl低渗液，用吸管轻轻吹打,使细胞均匀悬浮于低渗液中,放回37恒温水浴箱（或培养箱）中，静置15-20min，使白细胞膨胀，染色体分散、红细胞解体。2、预固定：向离心管中加入固定液（甲醇：冰乙酸3：1）1ml，轻轻混匀。3、离心以1000转/分钟，离心10分钟4、固定：吸去上清液，留下沉淀物。沿离心管壁加入新配固定液6-8ml，混匀，室温放置30分钟。5、离心以1000转/分钟，离心10分钟6、重复4、5步骤二遍使细胞经过3次固定，除第一次固定至少需30min外，其余两次固定，每次15或30min均可7、细胞悬液的制备 吸去上清液，加适当固定液，制成浓度适合的细胞悬液备用8、制片、显带和染色 1）制片：用吸管将细胞悬液轻轻混匀后吸取少量，从10cm高处滴至一端倾斜15经冰水或20%乙醇浸泡过的无脂玻片上,每篇滴2-3滴,然后在酒精灯火焰上来回通过数次,使其干燥；将制备的染色体标本片置鼓风干燥箱内37 过夜，取出后自然冷却至室温。 2）显带：染色缸中的45ml生理盐水，加2.5ml浓度为0.25%的胰酶溶液（胰酶最终浓度0.013%）用3%Tris35滴调整PH值为6.87.0，在37预热30分钟，将染色体标本片放入胰蛋白酶溶液中消化（恒温）。先将一张标本片分成三段进行预消化，以确定最佳消化时间，一般在30秒1分钟。 3）染色：将消化过的染色体标本片立即放入10%Giemsa染色液中染色5-10分钟；自来水轻轻冲洗35秒钟，晾干。 4）核型分析： 显微镜下常规计数20个分裂相，分析3个G带核型，（异常者分析5个）。如遇到嵌合休加倍计数和分析欢迎您下载我们的文档，后面内容直接删除就行资料可以编辑修改使用资料可以编辑修改使用致力于合同简历、论文写作、PPT设计、计划书、策划案、学习课件、各类