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一种依赖HrpB独立于型分泌系统的胞外天冬氨酸蛋白酶作为青枯菌的一种毒力因子周大祥 生物工程学院基因工程中心 学号：20111901005摘要：宿主特异性的青枯菌能够引起多种茄科植物萎焉，但对其认识还是很少。为了鉴定细菌的一个宿主特异性基因，选择典型菌株SL341（对辣椒有致病力，番茄无致病力）和SL2029（对番茄有致病力，辣椒无致病力）。我们发现来自SL2029的rsa1基因对SL341菌株失去辣椒萎焉能力。Rsa1基因编码一个11.8KDa的蛋白质，该基因上游有完整的共有hrp盒模体。尽管rsa1基因表达由HrpB一种hrp基因表达的转录活性因子激活，但Rsa1蛋白与天冬氨酸蛋白酶、组织蛋白酶D同源性较差，Rsa1蛋白拥有蛋白酶活性。两种特异性的天冬氨酸蛋白酶抑制剂抑肽素A和邻重氮乙酰-D,L-正亮氨酸甲酯能抑制该酶活性。将54和59位的天冬氨酸用丙氨酸取代，也会失去蛋白酶活性。SL2029菌株的rsa1突变体与野生型菌株相比毒力大大降低，不会引起辣椒萎焉症状。结果表明Rsa1蛋白是一种胞外天冬氨酸蛋白酶，在SL2029菌株侵染番茄扮演重要的作用。引言当植物在自然界遭遇致病菌时，致病菌有其特异性的易感宿主，它们能够定殖并成功的侵染。为了区分宿主-致病菌相互作用的特异性，通常会用到各种基因型和抗病品种。宿主特异性形成致病菌生理小种，它是由宿主抗性蛋白与致病菌无毒蛋白之间的直接或间接相互作用决定(Chisholm et al., 2006)。大多数细菌的无毒蛋白作为一种效应分子，经由宿主过敏性反应和致病菌型分泌系统(T3SS)进入植物细胞(Cornelis and Van Gijsegem, 2000; Mudgett, 2005; Staskawiczet al., 2001)。众所周知，效应蛋白具有酶活性，能提高细菌的毒力，T3SS对致病菌侵染植物是必须的(Mudgett,2005; Staskawicz et al., 2001)。在某些抗性植物中，抗性蛋白识别细菌的无毒效应分子，因此产生抗性(Chisholm et al., 2006)。 我们对青枯菌的宿主特异性非常感兴趣，青枯菌能够引起全球主要的经济作物，比如番茄、土豆、烟草、花生和香蕉等萎焉，入侵木质部导管。不像其他的植物致病菌，青枯菌通常根据侵染不同的植物分成生理小种。该菌有广泛的生理和遗传多样性，根据宿主范围被分成7个生化型和5个生理小种(Hayward, 1991)。生理小种1菌株最常见，能侵染许多茄科植物，如番茄、烟草和辣椒等，生理小种3菌株对土豆具有高致病性，而对辣椒无致病力(Boucher et al.,1985)。 为了理解青枯菌的致病分子机制，hrp基因簇主要编码T3SS蛋白，改基因簇被深入研究(Cunnac et al., 2004a, b)。基于生理小种1菌株GM1000和RS1000基因组信息，依赖于T3SS的效应分子报道较多(Mukaihara et al., 2010; Poueymiro and Genin, 2009)。因为没有对5中生理小种抗病的植物，所以很难解释基因-基因相互作用。来自青枯菌株AW1的avrA基因负责诱导烟草过敏反应，该基因被克隆，AW1菌株Avr突变体失去诱导烟草过敏反应的能力，对烟草不致病(Carney and Denny, 1990)，是另外的对烟草无毒力基因(popP1）存在的结果。当另一个avr基因缺失时，avrA基因表现为一种典型的avr基因(Poueymiro and Genin, 2009)。 popP1和popP2是青枯菌的两个avr基因，在GM1000菌株中被鉴定(Deslandes et al.,2003; Lavie et al., 2002)，popP1和popP2基因表达依赖于关键的转录因子HrpB，该因子控制大多数hrp基因表达(Deslandes et al., 2003; Lavie et al.,2002; Occhialini et al., 2005)。PopP1基因表现为典型的avr基因，对矮牵牛花无致病力(Lavie et al.,2002)。PopP1和PopP2蛋白是T3SS效应蛋白，属于YopJ/AvrRxv家族，与类泛素蛋白酶1相似(Deslandes et al., 2003; Lavie et al., 2002)。PopP2被拟南芥生态型Nd-1的RRS1-R识别，PopP2和 RRS1蛋白定位在细胞核(Deslandes et al., 2003)。然而，和其他叶致病菌相比，还是不能解释青枯菌和天然宿主之间的基因-基因抗性。结果rsa1基因鉴定我们选择SL341菌株和SL2029菌株，SL341菌株对番茄和辣椒致病，而对土豆和烟草不致病，SL2029菌株对土豆致病，对番茄致病力很弱，对辣椒和烟草不致病。我们将SL2029菌株的基因组文库转入SL341中，携带pRS1柯斯质粒的SL341菌株改变了宿主特异性，携带pRS1质粒的SL341菌株对辣椒不致病，野生型SL341菌株能引起辣椒萎焉(Figs 1A and 2A)。限制性酶消化分析表明pRS1有大约25kb的插入(Fig 1A)，将带有pRS1 1kb HindIII/PstI片段的pRS13插入SL341菌株，表现为对辣椒不致病(Fig 2A)。对带pRS13的1kb HindIII/PstI片段进行完整的DNA序列分析发现一个可能的开放阅读框（ORF），命名为rsa1基因(Fig. 1B; GenBank 序列号：EU707808)。rsa1基因有330个碱基，预测编码大约11.8kDa的蛋白质，比对发现与青枯菌GM1000菌株（生理小种1）推定的跨膜蛋白(gene RSp1467)有49%的同源性和61%的相似性，与MolK2菌株（生理小种2）的假定蛋白(gene RSMK03424)有48%的同源性和63%的相似性，与UM551菌株（生理小种3）的假定蛋白(gene RRSL03065)有40%的同源性和54%的相似性。Rsa1蛋白（6-69位氨基酸）与MEROPS蛋白酶数据库中的天冬氨酸组织蛋白酶D有26%-28%同源性(Rawlings et al., 2008)。同时，在54位和59位发现有两个天冬氨酸残基，具有天冬氨酸蛋白酶活性位点(Fig. 1B)。完整的hrp盒包括两个正向重复序列（TTCG），它们被16bp的碱基分隔开，hrp盒位于rsa1基因推定的翻译起始位点上游280bp处，发现与GM1000菌株相似(Fig. 1B)。Fig. 1 菌株rsa1基因鉴定 (A) 携带rsa1 Fig.2 青枯菌SL341和SL2029修饰菌株对辣椒基因的质粒限制性酶图谱和携带每个质 （A）和番茄（B）的致病性；1, water control; 2,粒的SL341菌株对辣椒的致病性(-, avirul- SL341; 3, SL2029; 4, SL341(pRS13); 5, SL2029 ent; +, virulent)。(B) rsa1基因的和核苷酸 rsa1:Tn3-gusA200; 6, SL2029 和氨基酸序列。箭头显示Tn3-gusA插入的位 rsa1:Tn3-gusA200(pRS13)。分别回接辣椒（21 置和方向。矩形框的核苷酸序列是完整的 天）和番茄（15天）后照相。共有hrp盒基序，下划线表示信号肽序列。限制性内切酶位点：H, HindIII; E, EcoRI. RBS 假定的核糖体结合位点。rsa1对SL2029菌株致病力非常重要含有rsa1基因的SL341菌株对辣椒不致病，我们对pRS1质粒用Tn3-gusA诱变处理，产生SL2029菌株的rsa1基因突变体。Tn3-gusA200插入在rsa1基因的中间编码区(Fig. 1B)。pRS1:Tn3-gusA200质粒转移进入SL2029菌株，进行染色体交换，用转移了pRS1:Tn3-gusA200质粒的SL2029 rsa1基因敲除菌株接种辣椒，15天后不致病(Fig. 2A)。将带有rsa1基因的pRS13质粒转入SL2029 rsa1基因敲除菌株，rsa1基因回复后，还是没有表型变化，对辣椒不致病(Fig. 2A)。结果表明在SL2029菌株中有另外的avr基因引起辣椒产生抗性。为了确定rsa1基因在SL2029菌株对番茄致病中扮演的作用，我们将SL2029 rsa1基因敲除菌株与SL2029野生型菌株和SL341菌株一起接种到番茄上，SL2029 rsa1基因敲除菌株比野生型菌株致病力大大降低(Fig. 2B)，用含有rsa1基因的pRS13质粒转入SL2029 rsa1基因敲除菌株进行回复实验，对番茄的致病性恢复(Fig. 2B)。结果表明SL2029菌株的Rsa1蛋白对番茄致病非常重要。我们也检测了SL341和SL2029菌株的生长情况，将携带pRS13质粒的SL341菌株、SL2029菌株rsa1基因突变体和含有pRS13质粒的SL2029 rsa1基因敲除菌株接种到番茄茎部20天后，检测细菌在植物体内的生长情况。SL341菌株缓慢减少，野生型SL2029菌株在番茄体内生长良好，接种14天后，达到大约11010cfu/g茎组织，而SL2029 rsa1基因敲除菌株数量到接种20天时增长缓慢(Fig. 3)，将pSR13质粒转入SL2029 rsa1基因敲除菌株和SL341菌株后，含有pRS13质粒的SL2029 rsa1基因敲除菌株数量增加，但没有达到野生型水平(Fig. 3)。Fig.3 青枯菌在番茄中的生长方式。SL341 ( ),SL2029 ( ), SL2029 rsa1:Tn3-gusA200 ( ), SL341(pRS13) ( ) SL2029 rsa1:Tn3-gusA200(pRS13) ( )，接种后每2天测定细菌数量，五次重复，垂直线为误差范围。rsa1基因由HrpB调控共有hrp盒基序位于rsa1基因的启动子区，我们检测了SL2029 rsa1基因敲除菌株、-葡萄糖醛酸酶活性，将携带hrpB基因的pRS20质粒转入这些菌株，确定rsa1基因的表达是否由HrpB调控。当细菌在MMG培养基生长时，Rsa1基因表达野生型是hrpB:的40倍(Fig. 4)，rsa1基因通过将含有hrpB基因的pRS20质粒转入SL2029 hrpB: rsa1:Tn3-gusA200菌株中，基因在hrpB:的表达水平增加(Fig. 4)。结果表明rsa1基因表达依赖于HrpB，rsa1基因属于HrpB调控单元。Fig.4 青枯菌SL2029菌株在MMG培养基上2824h生长，rsa1基因的表达水平。SL2029 (1),SL2029 rsa1:Tn3-gusA200 (2),SL2029rsa1:Tn3-gusA200(pRS20) (3),SL2029 rsa1:Tn3-gusA200, hrpB: (4) and SL2029 rsa1:Tn3-gusA200, hrpB: (pRS13) (5)菌株的-葡萄糖醛酸酶活性，三次重复，一个-葡萄糖醛酸酶活性单位定义为每个细菌每分钟释放1nmol的4-甲基伞形酮。垂直线为标准误。Rsa1蛋白不依赖于Hrp T3SS分泌为了明确Rsa1蛋白的分泌是否依赖于Hrp T3SS，分析野生型和hrcN基因（编码T3SS的内膜相关ATP酶；Pozidis et al., 2003）突变体菌株的Rsa1分泌情况。野生型SL2029菌株透过番茄叶片，观察典型的HR。而SL2029 HrcN突变体菌株不能产生HR，表明HrcN突变体是T3SS突变体。来自于野生型SL2029菌株、SL2029 rsa1基因突变体菌株和SL2029 hrcN基因突变体的菌株，它们携带pLAFR3质粒（对照）或pRS13质粒，在MMG培养基上生长后，利用多克隆抗体的免疫印迹技术检测胞内和胞外蛋白，这些抗体能够结合Rsa1蛋白。分别检测培养基上清、野生型SL2029菌株和SL2029 hrcN基因突变体菌株的菌体。发现SL2029 rsa1基因突变体菌株胞内或胞外都不存在Rsa1蛋白(Fig. 5)。将带有rsa1基因的pRS13质粒转入SL2029 rsa1基因突变体菌株，Rsa1蛋白在胞内和胞外都能够检测到(Fig. 5)。结果显示分泌蛋白Rsa1是不依赖于Hrp T3SS。Fig.5 基于抗-Rsa1的Western blot分析Rsa1蛋白的分泌。1，SL2029(pRS13)胞内蛋白；2，SL2029(pRS13)培养液上清；3，SL2029 rsa1:Tn3-gusA200(pLAFR3)胞内蛋白；4，SL2029 rsa1:Tn3-gusA200(pLAFR3) 培养液上清；5，SL2029 rsa1:Tn3-gusA200(pRS13)胞内蛋白；6，SL2029 rsa1:Tn3-gusA200(pRS13)培养液上清；7，SL2029 hrcN:Tn3-gusA20(pRS13)胞内蛋白；8，SL2029 hrcN:Tn3-gusA20(pRS13)培养液上清。箭头表示Rsa1蛋白。野生型SL2029菌株和携带有pRS13的SL2029 hrcN基因突变体菌株分泌Rsa1蛋白，利用Rsa1-His纯化蛋白确定蛋白的N-端氨基酸序列是否有信号肽。从大肠杆菌上清液纯化Rsa1的N-端氨基酸序列，发现在大肠杆菌分泌蛋白中，前面的29个氨基酸残基断开，与SignalP 3.0 Server软件预测一致。Rsa1是一胞外天冬氨酸蛋白酶将Rsa1蛋白与组织蛋白酶D进行同源性比对，我们利用casein-BODIPY蛋白酶分析试剂盒确定Rsa1蛋白在体外是否有天冬氨酸蛋白酶活性。重组野生型Rsa1蛋白显示蛋白酶活性很高，但是比组织蛋白酶D或肾素低(Fig. 6)。在磷酸钠缓冲液中，Rsa1-His蛋白酶的最适pH和最适温度分别是Ph6.5和25(Fig. 7)。组织蛋白酶D属于天冬氨酸蛋白酶A1家族(Rawlings and Barrett, 1995)，我们将Rsa1蛋白的54位和59位保守的天冬氨酸残基用丙氨酸取代，分别产生Rsa1D54A 和Rsa1D59A蛋白突变体，这两个蛋白突变体都没有Rsa1-His蛋白酶活性(Fig. 6)。数据显示Rsa1-His是一种蛋白酶，54位和59位的天冬氨酸残基对酶的活性至关重要。Fig.6 在体外对纯化的Rsa1蛋白、肾素、组织蛋白酶D和Rsa突变体蛋白进行活性分析。每种酶分别用没有抑制剂（）、2mM抑肽素A（）50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)25处理20min和2mM邻重氮乙酰-D,L-正亮氨酸甲酯（）50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)（包含0.13mMCuSO4）25处理1h。三次重复，垂直线表示标准误。两个相邻的天冬氨酸残基对Rsa1-His的活性至关重要，我们还检测了Rsa1-His是否属于天冬氨酸蛋白酶，利用两种已知的天冬氨酸蛋白酶抑制剂抑肽素A和邻重氮乙酰-D,L-正亮氨酸甲酯（DAN），确定是否抑制Rsa1蛋白、肾素和组织蛋白酶D的活性。结果发现抑肽素A分别抑制Rsa1蛋白、肾素和组织蛋白酶D20%、13%和87%的活性，DAN分别抑制70%、84%和26%(Fig. 6)。结合rsa1基因突变体分析，说明Rsa1-His是一种天冬氨酸蛋白酶。Fig.7 Rsa1蛋白酶在不同pH值（A）和温度（B）的活性。蛋白活性测定使用500MRsa1-His（50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)）25处理1h。使用casein-BODIPY蛋白酶分析试剂盒。讨论我们鉴定出Rsa1蛋白是青枯菌的类Avr蛋白，基于以下两个表现改变：携带rsa1基因的SL341菌株对辣椒不致病， SL2029 rsa1基因突变体菌株对番茄致病力大大降低，而SL2029 rsa1基因突变体菌株对辣椒不致病，与AW1 avrA突变体菌株表型相似(Carney and Denny,1990)。就这一点而言，好像rsa1基因并不是一个典型的avr基因，根据SL2029 rsa1突变体菌株对辣椒不致病的事实，说明它是另外的Avr因子与avrA突变体中的观察一致(Poueymiro and Genin, 2009)。SL2029 rsa1突变体菌株在番茄中的生长情况与疾病的发展正相关，这些表型变化与其他的avr基因突变体一致(Bai et al., 2000; Lim and Kunkel, 2005; Ong and Innes, 2006; Ritter and Dangl, 1995)。类似的表型变化在青枯菌GM1000 popP2突变体也被报道，拟南芥生态型Nd-1和易感生态型Col-5抗该突变体(Deslandes et al., 2003)。然而，还不清楚PopP2在拟南芥易感生态型Col-5中的致病中是否扮演任何作用。青枯菌GM1000 popP2突变体在易感生态型Col-5中的数量和野生型增长相似(Deslandes et al., 2003)。暗示Rsa1和PopP2蛋白可能在抗病和易感植物中有不同的作用。许多植物致病菌Avr蛋白的生化功能主要表现为酶活性(Axtell et al., 2003; Roden et al., 2004; Shao et al.,2003)。这就说明Rsa1蛋白拥有天冬氨酸蛋白酶活性是正常的。但是，Rsa1蛋白并不属于任何已知的Avr效应蛋白群，原因有二：1.首次发现Rsa1蛋白具有天冬氨酸蛋白酶活性，可能起着植物质外体的功能。2.Rsa1蛋白不像其他的细菌Avr效应蛋白，并不是T3SS的组分，Rsa1蛋白在N-端氨基酸序列有一个信号肽，可能由T2SS分泌。这个发现出乎意外，因为大多数已知的细菌Avr蛋白由T3SS分泌(Kjemtrup et al., 2000; Yucel et al., 1994)。这是一个不依赖于T3SS的无毒分泌蛋白分子：Xanthomonas oryzae pv.oryzaeAvrXa21中，分泌分子依赖于RaxABC T1SS (Lee et al.,2009)。在真菌Cladosporium fulvum中，菌体生长限定在导管的空间，Avr蛋白具有信号肽序列，定位在导管(Joosten et al.,1994; Stergiopoulos and deWit, 2009)。ra1基因表达依赖于HrpB，表明HrpB调节基因并不局限在编码T3SS效应蛋白和基质表达(Delaspre et al., 2007;Occhialini et al., 2005)，之前我们报道Burkholderia glumae的胞外蛋白组中16个胞外蛋白不受HrpB调控，而是由T2SS分泌(Kang et al.,2008)。在X. oryzae pv. Oryzae中，编码半胱氨酸蛋白酶的cysP2基因表达由关键的hrp基因转录调节因子控制，HrpXo和青枯菌的HrpB相似，不过CysP2蛋白是由T2SS分泌的(Furutani et al., 2004)。因此，革兰氏阴性植物致病菌的两个hrp基因调节因子HrpB和HrpX不仅涉及T3SS的基因编码调节，还涉及T2SS。许多细菌的avr基因中，Avr蛋白数量相对较小，Avr效应分子常常作为蛋白酶，修饰植物目标蛋白，提高致病性，抑制免疫激活，完成易感植物侵染(Chisholm et al., 2006)。Rsa1蛋白好像属于天冬氨酸蛋白酶A家族，因为活性位点有两个相邻的天冬氨酸残基(Rawlings et al., 2008)，但是，不像其他的天冬氨酸蛋白酶A1家族在酸性环境活性最强，Rsa1蛋白的最适pH为6.5，像肾素的最适pH，为中性(Rawlings et al., 2008)。可能与植物处于中性环境中有关。生理小种1GM1000菌株和小种3UW551菌株的比较基因组学分析证明UW551菌株的ORFs是独一无二的(Gabriel et al., 2006)，几个推测的avr基因在UW551菌株中被发现，这些基因限制了小种3在烟草上的宿主范围，然而rsa1的同源基因在推测的UW551菌株的T3SS效应蛋白是不存在的(Gabriel et al., 2006)。并不意外，因为来自UW551菌株的推测的avr基因都依赖于T3SS的效应蛋白。虽然如此，Rsa1同源蛋白在小种1、2和3中的数据库中都已发现，以后将确定这些同源蛋白的功能与Rsa1是否相似。如果青枯菌SL2029菌株的Rsa1蛋白是基因-基因之间的典型相互作用模式的话（例如RRS1-R和PopP2），那么，Rsa1蛋白的受体可能来自于辣椒和番茄，辣椒和番茄的Rsa1蛋白受体是由植物细胞分泌或是细胞壁表面蛋白。一旦Rsa1蛋白受体被鉴定，我们将发现一种新的Avr类蛋白功能类型，这种蛋白来自于以前未发现的Rsa1蛋白酶功能的植物致病菌。实验程序菌株与培养条件菌株和质粒见表S1，青枯菌代表菌株SL341和SL2029在以前的基础研究中被选用(Jeong et al., 2007)，大肠杆菌在37LB培养基上生长(Sambrook et al.,1989)，青枯菌生长于28TZC培养基(Kelman, 1954)，MMG培养基常常用于hrp诱导培养基(Boucher et al., 1985)，抗生素使用浓度：四环素10g/mL，卡那霉素50g/mL，氨苄霉素50g/mL。重组DNA技术所有的DNA操作见Sambrook et al. (1989)，为了构建SL2029菌株的基因组文库，总DNA用Sau3A1不完全消化，20-30kb的片段连接进入pLAFR3质粒的BamHI位点，转化进大肠杆菌HB101，所有的转移进入青枯菌的质粒是pLAFR3修饰。标记交换突变科斯质粒PRS20携带hrpB和其他的hrp基因，从SL2029菌株的基因组文库中分离(Kim et al., 2003)，1130bp的SalI片段包含B. glumae的hrcQRS区域，用于杂交DNA探针(Kang et al., 2008)。pRS1和pRS20质粒带有rsa1和hrp基因，分别用Tn3-gusA突变，每个突变体的准确插入位点和Tn3-gusA的方向见(Kim et al., 2003)。-葡萄糖醛酸酶分析-葡萄糖醛酸酶分析见以往的资料，另外，青枯菌生长在MMG培养基中2824h (Kim et al., 2003)。植物分析所有植物生长在商用土种，温室的塑料钵里面，番茄、土豆和辣椒的致病性测定：使用5-6叶期的植物根部，浸泡1108cfu/mL的菌悬液2h。为了测定细菌在番茄中的生长情况，菌悬液的使用浓度为1106cfu/mL，注射进入5-6叶的植物茎部，接种植物在25-35的温室中。来自于注射周围的1g茎组织浸泡在1mL的蒸馏水中，细菌数量由叶盘法测定。Rsa1蛋白分泌分析来自于SL2029衍生系菌株的胞外和胞内蛋白见(Kim et al., 2003)，来自于Rsa1的合成蛋白用于使用鼠抗Rsa1抗体，用1:5000的Rsa1抗体进行免疫分析(Kim et al., 2003)。Rsa1蛋白信号肽预测与N-端序列Rsa1蛋白信号肽位点预测用SignalP 3.0 Server (Bendtsen et al.,2004)，为了纯化Rsa1，rsa1基因编码序列克隆入pET-21a的NdeI/BamHI位点，形成Prs69质粒，Ni-NTA Superow Columns纯化上清中的标签蛋白(Qiagen,Valencia, CA, USA)。rsa1基因突变方向位点54位和59位的天冬氨酸残基换成丙氨酸，分别形成Rsa1D54A和Rsa1D59A (Li and Wilkinson, 1997)。两个互补的引物用于pRS13质粒PCR反应作为模板，突变之后，确定DNA序列。Rsa1蛋白酶活性分析蛋白酶活性测定用500nMRsa1蛋白，蛋白溶于50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中，25处理1h，用casein-BODIPY蛋白酶试剂盒测定(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。分别用抑肽素A(Sigma-Aldrich Corp., St Louis, MO, USA)、DAN(Sigma)、组织蛋白酶D(Sigma)和肾素(Sigma)作为天冬氨酸蛋白酶抑制剂相同处理(Rawlings et al., 2008)，荧光分光光度计F-4500测定（激发波长505nm，发射波长480nm，Hitachi, Tokyo, Japan)，重复三次。REFERENCESAxtell, M.J., Chisholm, S.T., Dahlbeck, D. and Staskawicz, B.J. 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