对羧基苯硼酸-明胶纳米微球制备及抗肿瘤疗效研究-本科毕业论.doc

本科毕业论文（设计、创作）题目：对羧基苯硼酸-明胶纳米微球制备及抗肿瘤疗效研究题目类别： 论 文 设 计 创 作 学生姓名： XXX 学号： XXXXXXX 所在院系： 生命科学学院 专业：生物技术 入学时间： 2012 年 9 月导师姓名： 王鑫 职称/学位： 教授 导师所在单位： 安徽大学生命科学学院 完成时间： 2016 年 6月安徽大学教务处制对羧基苯硼酸-明胶纳米微球制备及抗肿瘤疗效研究摘 要目标：以明胶为起始材料制备纳米微球，并在其表面修饰具有肿瘤靶向功能的小分子配体对羧基苯硼酸。方法：利用不良溶剂法制备不同明胶纳米微球，利用对羧基苯硼酸的羧基与明胶微球表面的氨基形成酰胺键制备靶向纳米微球。利用动态光散射研究了纳米微球的粒径分布以及在不同生理条件下的稳定性。利用动态光散射纳米激光粒度仪测量了纳米微球在不同pH值下的表面电荷变化。利用透射电子显微镜来察看了纳米微球的表形特征。负载抗肿瘤药物阿霉素，并探究了载药纳米微球的体外释放行为。结果：制备的明胶纳米微球及靶向纳米微球粒径在160 nm左右。稳定性实验分析数据表明纳米微球在不同生理环境下都具有良好的稳定性。体外药物释放实验证明负载阿霉素的纳米微球可以顺利的将药物释放出来，且释放行为具有一定的pH依赖性。细胞毒性实验证明载药纳米微球可以很好的抑制人结肠癌细胞的生长。关键词：对羧基苯硼酸；明胶；纳米微球；抗肿瘤4-Carboxyphenylboronic acid - gelatin nanoparticles preparation and antitumor efficacy researchAbstractObjective: Gelatin was chosen as an initial material to prepare nanoparticles. 4-Carboxyphenylboronic acid (4-CPBA) was then modified on the surface of gelatin nanoparticles to give tumor-targeting nanoparticle drug delivery systems. Methods: The size and distribution of these two nanoparticles were measured by dynamic light scattering (DLS). The micromorphology of nanoparticles was observed by transmission electronic microscope (TEM). Zeta potential of gelatin nanoparticles and 4-CPBA modified nanoparticles was measured by DLS. The stability of these two nanoparticles in different conditions were then investigated. Drug release from nanoparticles were measured at pH 5.0, 6.0 and 7.4. Cytotoxicity of these two nanoparticles were evaluated against HCT cell line. Results: TEM images display that gelatin nanoparticles and 4-CPBA modified nanoparticles are spherical like with a uniform diameter around 160 nm. Both tow nanoparticles display an extraordinary stability in different conditions. DOX was successfully loaded into NP1 and NP2, and DOX release rate from nanoparticles increase significantly with the change of pH value from 7.4 to 5.0. The results of MTT assay demonstrated that these DOX-loaded nanoparticles can efficiently inhibit the growth of HCT cells.Key words: 4-Carboxyphenylboronic acid; Gelatin; nanoparticles; antitumor目 录1 引言11.1 明胶的基本概述11.2 载药纳米微球的基本概述11.3 肿瘤治疗的基本概述21.4 论文选题意义22 实验方法32.1 材料及仪器32.2 实验步骤32.2.1 明胶以及4-羧基苯硼酸修饰的明胶纳米粒子的制备32.2.2 NP1和NP2的粒径以及电位表征32.2.3 NP1和NP2稳定性检测42.2.4 NP1-DOX和NP2-DOX的制备42.2.5药物释放42.2.6 NP1-DOX和NP2-DOX的细胞毒性试验43 结果讨论53.1 NP1和NP2的粒径以及电位表征53.2 NP1和NP2稳定性63.3 药物释放73.4 NP1-DOX和NP2-DOX的细胞毒性试验84 结论10主要参考文献：11致谢121 引言1.1 明胶的基本概述明胶是胶原部分水解而产生的变性产物，这类胶原一般存在于动物骨、肌键、膜等结缔组织中。是多种氨基酸与肽类交联形成的直链聚合物，它是一种无色无味，无挥发性、透明坚硬的非晶体物质，可溶于热水、醋酸、甘油等溶液。不溶于冷水（但可以缓慢吸水膨胀软化，）、苯、乙醚、丙酮及大部分非极性的有机溶剂。明胶根据制备方法不同，可以分为酸法与碱法明胶。如今，明胶在食品、医药卫生、工业和照明等方面应用比较广泛。其理化性质主要有：溶解和溶胀，生物可降解性和生物相容性，乳化性质和凝胶化等。虽然明胶在耐水性和力学性能方面较差，且在阴暗潮湿的环境中比较容易受腐化等缺点，但是明胶含有多种较高活性的官能团，它们通过改进明胶的机能以此来满足明胶在不同领域的运用。明胶在改性后不仅能够保留原有的天然高分子材料的生物降解特性,而且还能在提高力学性能的同时产生新的生物学特征。1.2 载药纳米微球的基本概述根据微球的组成材料不同，微球可以分为有机聚合物微球和无机微球。其中有机聚合物划分为三种类型，即天然高分子微球、半合成高分子微球和合成高分子微球。天然高分子的材料主要是蛋白类和多糖类,它的特点是化学稳定性、成球性、生物兼容性和生物降解性比较好，并且其降解的产物没有毒副作用，所以该材料是组成纳米微球的首选材料。有几种材料运用的特别频繁。其一是就是明胶，明胶是目前应用较多的一种天然载体材料，其最大的特点是具有生物相容性、生物降解性，生物活性较高、无毒且无抗原性；其二是壳聚糖，壳聚糖经羧甲基化后其生物性能大大提高。半合成高分子材料主要是纤维素类衍生物，其优点是毒性小、粘度大、易溶解，但该类物质较易水解且高温条件下不容易制备。合成高分子的材料主要有聚烯烃、聚多元醇类等，其具有无毒、成球性好、化学稳定性高等优点，可根据性能要求的不同，通过对材料进行调整和改变制备方式，制备我们所需要的载药微球，且缓释特性不易受外界环境影响，效果比较明显。无机微球的材料主要包括陶瓷、硅胶、碳等。纳米微球是指应用天然高分子材料构成的纳米粒子，其粒径大小一般在10-1000 nm之间。纳米粒子能将药物包裹在微球之中或吸附在其表面，通过细胞胞吞进入细胞内，并随着聚合物材料的降解逐渐释放出药物，从而发挥其治疗的效能。纳米微球粒径小，不易被机体网状内皮细胞清除，有效避免脾滤过效应，通过增加渗透和滞留效应增强靶组织累积的优势，尤其是在肿瘤部位能够高效累积，这对于提高癌症靶向作用具有很大价值。1.3 肿瘤治疗的基本概述肿瘤肿瘤的一般传统治疗方法主要有手术、放疗、化疗三种，加上我国特有的中医中药及新兴的生物免疫治疗方法，一共有五种传统治疗手段。手术是指用外科治疗手段清除局部瘤体的一种治疗方法，由于手术为局部治疗法，只能清除原发瘤体及周围淋巴结但它对其他部位如血液系统和淋巴系统里游离的癌细胞则无法消灭，所以会有癌细胞转移和癌症复发的潜在危害。患者如果没有得到有效处理则很快形成转移瘤体，严重危害生命。放疗是利用局部高能量放射线的照射来破坏癌细胞。尽管放疗直接清除杀死肿瘤细胞，但它和手术一样是局部治疗措施，无法对血液系统和淋巴系统里游离的癌细胞进行杀死，并且有很大的副作用，会对损坏人体的正常组织，也会使新的细胞发生癌变。化疗是运用化学药物清除肿瘤细胞，但是它没有良好的分别系统的。虽然杀死清除了肿瘤细胞，但它同时也杀死了一些机体正常的细胞，具有更大的毒副作用，多次使用后肿瘤细胞还产生耐药性，不可逆转性，甚至危及我们的生命。中医中药是我国特有的传统医治方法，通过用中药改善肿瘤患者身体健康从而提高患者免疫力，但在抗肿瘤复发和转移上，缺乏科学标准，缺乏相关的临床数据，作用并不明确且对肿瘤局部的控制作用较差。生物免疫疗法是改善人体的免疫功能来治疗肿瘤，但人体的免疫系统是多向复杂的，免疫效应只能杀死部分的癌细胞，对于那些晚期的病人没有良好的治愈效果，也没有好的方法去应付肿瘤的复发和转移。由此可见，传统治疗肿瘤的方法还有很多的弊端，而载药纳米微球的研究应用很可能突破这些传统肿瘤治疗的弊端。用天然高分子材料作为载体的微球加以4-羧基苯硼酸修饰不单单能以一定速度控制药物释放,还可反应出人体的各项生理指,因而可以运用为靶向药物释放体系。载药纳米微球包裹药物过程可以延长药物的生理活性,提高药物稳定性,并使药物的释放和治疗有了的成效。研究证明通过载药微球能够提高许多传统药物治疗的效率，在抗肿瘤药物治疗领域，具有非常广阔的前景。1.4 论文选题意义近年来，高分子纳米微球在医学领域得到了广泛的应用,临床上有很多药物被限制使用，这些药物需要用通过高分子材料来包埋从而得到治疗使用。明胶作为一种天然高分子材料，来源丰富，制备简单，价格低廉，并且无毒性，无免疫原性，具有大量的细胞识别位点、良好的生物相容性和生物降解性。本实验在此基础上选用明胶作为主要材料制备纳米微球，通过用4-羧基苯硼来酸修饰明胶纳米微球装载盐酸阿霉素，研究该载药纳米微球在抗肿瘤方面的运用。2 实验方法2.1 材料及仪器明胶 (Gelatin)；醋酸；乙醇；盐酸阿霉素 (DOX)；戊二醛 (GA)；二甲亚砜 (DMSO)；4-羧基苯硼酸 (4-CPBA)；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDCHCl)；N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)；96孔板；细胞培养基RPMI 1640；胎牛血清；胰蛋白酶；动态光衍射激光粒度仪（DLS）；高速离心机；二氧化碳细胞培养箱；生物安全柜；透射电子显微镜（TEM）2.2 实验步骤2.2.1 明胶以及4-羧基苯硼酸修饰的明胶纳米粒子的制备明胶纳米粒子的制备（NP1） 首先将20 mg的明胶和0.2 mL的醋酸加入到2ml的去离子水中，加热至37并持续搅拌直到明胶完全溶解；将6ml的乙醇逐滴加入到缓慢搅拌的明胶水溶液中得到蓝白色乳浊液；30微升的戊二醛作为交联剂加入到上述乳浊液中交联反应6h；在9000rpm离心10 min得到明胶纳米粒子 （NP1），并用3 mL的去离子水再分散备用。4-羧基苯硼酸修饰纳米粒子制备（ NP2 )将12 mg的4-羧基苯硼酸溶解在1 mL的二甲亚砜中，然后加入16.6 mg的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐 （EDCHCl) 和 10 mg的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）对4-羧基苯硼酸的羧基进行活化；将活化后的4-羧基苯硼酸加入到5 mL上述NP1分散液中，通过活化的羧基与NP1表面的氨基反应得到修饰后的纳米粒子。通过在9000rpm离心15min得到修饰过后的纳米粒子（NP2）。2.2.2 NP1和NP2的粒径以及电位表征 通过动态光衍射（DLS）粒径仪检测两种纳米粒子的粒径分布以及表面电位，首先将纳米粒子分散液的浓度调节到1 mg/mL，然后通过DLS检测并重复3次。通过透射电镜(TEM)来检测纳米粒子的表面形貌，对于TEM的具体步骤如下：首先滴一滴适当浓度的纳米粒子分散液于预先准备的铜网上，室温下自然晾干后由TEM检测。2.2.3 NP1和NP2稳定性检测 为了了解两种纳米粒子的时间稳定性以及在生理盐水、PBS、培养基、血清和不同pH等条件中的稳定性，于是我们通过DLS检测两种纳米粒子在不同的条件下的粒径以及光强的变化。具体步骤如下：对于时间稳定性，我们用去离子水分散两种纳米粒子，浓度为1mg/ml左右，然后我们分别在不同时间检测纳米粒子的粒径和光强；对于其他条件下的稳定性，我们用相应的溶液分别去分散两种纳米粒子，然后用DLS检测。2.2.4 NP1-DOX和NP2-DOX的制备 分别将3 mL的NP1和NP2分散液的pH值调节到8.5左右，然后加入1 mg的盐酸阿霉素 (DOX) 于分散液中，避光搅拌过夜。9000 rpm离心10min，收集沉淀，用3 mL去离子水再分散后冻干并称重，两种载药粒子分别命名为NP1-DOX和NP2-DOX。上清为未被包载的阿霉素溶液，通过酶标仪检测上清的紫外吸光度，带入阿霉素-吸光度标准曲线得出上清阿霉素浓度，从而得出未被包载的阿霉素的量。两种纳米粒子的载药量（DLC）和载药效率（DLE）计算方法如下： DLC=被包载阿霉素量/载药纳米粒子量100% DLE=被包载阿霉素量/总药量100%2.2.5 药物释放 将NP1-DOX和NP2-DOX的阿霉素浓度调节到500 g/mL，然后分别取1 mL加入到截留分子量为14 kDa的透析袋中并将透析袋加入到50 mL的离心管中，在离心管中加入不同pH值（5.0、6.0和7.4）磷酸缓冲液，然后将该离心管放在震荡频率为100 rpm,温度为37的摇床中；最后在预先设定的时间点取出离心管中的缓冲液并加入新鲜缓冲液，通过酶标仪检测取出的缓冲液中阿霉素的含量。2.2.6 NP1-DOX和NP2-DOX的细胞毒性试验 首先将一定浓度的HCT细胞加入到96孔板中，贴壁过夜，当96孔板的每孔细胞浓度达到5103个左右，分别加入不同浓度的NP1、NP2、Free DOX、NP1-DOX和NP2-DOX共培养24 h和48 h。培养结束后，吸去每孔中的培养基，重新加入180 L新鲜培养基以及20 L浓度为5 mg/mL的MTT溶液，共培养4 h后去除96孔板中的培养基，加入150 L的二甲亚砜，震荡10 min，最后通过酶标仪姜策每孔的紫外吸收，检测波长为570 nm。3 结果讨论3.1 NP1和NP2的粒径以及电位表征 图 1. NP1（左），NP2（右）透射电子显微镜图片 图2. 两种纳米微球在不同pH值下表面电位变化 从TEM图可以看出NP1和NP2的形状规整，都为球形，粒径分布均一，大部分分布在100nm左右，与DLS检测结果（160nm左右）相比有所减小，这是由于电镜样品中纳米粒子干燥出现皱缩的结果。从电位分析图可以看出，由于NP1和NP2表面带有氨基和羧基，在pH4左右，由于氨基质子化而带正电，随着NP1和NP2乳液环境的pH不断提高，氨基去质子化，羧基电离，因此两者的电位从20 mV不断降低，在pH5.5左右达到最低，约为-20 mV，以后电位并没有多大变化。3.2 NP1和NP2稳定性 图3. NP1（左），NP2（右）在水溶液中保存一周，粒径及光强变化 图4. NP1（左），NP2（右）在生理盐水、磷酸盐缓冲溶液、细胞培养基及胎牛血清中的粒径及光强变化 图5. NP1（左），NP2（右）在不同pH值下粒径及光强变化 从图中可以看出，从第1天到第9天，两种纳米粒子的粒径以及光强都没有太大变化，说明两种纳米粒子都具有良好的时间稳定性，可以长期保存在水溶液中。NP1在血清中的粒径有所降低，光强提高，而在生理盐水、PBS、培养基中变化不大；NP2在培养基中粒径有所降低，光强基本不变；对于不同的pH值下的稳定性，两种纳米粒子都在pH7-9之间的粒径略微降低，光强增强。总体而言，两种纳米粒子在不同条件下具有良好的稳定性，非常适合于药物载体。3.3 药物释放图6. 负载阿霉素的明胶纳米微球在不同pH值下药物释放结果图7. 负载阿霉素的明胶纳米微球在不同pH值下药物释放结果通过将阿霉素盐酸盐分散在纳米微球水溶液中的方法得到负载药物的明胶纳米微球（NP1-DOX）及对羧基苯硼酸修饰的纳米微球（NP2-DOX）。进一步探究了两种载药纳米微球的体外药物释放行为。分别将两种纳米微球置于不同pH值（5.0,6.0,7.4）的磷酸盐缓冲溶液中，得到药物释放曲线。从释放结果可以很明显的看出药物释放行为具有一定的pH依赖性，药物释放速度及释放百分比随着pH值的下降而升高，且NP1-DOX及NP2-DOX的药物释放趋势相似。对NP1-DOX而言，pH7.4下释放120 h后仅有28%的药物释放出来，而当pH值下降到6.0和5.0时，释放量上升至54%和85%。此外，pH7.4下NP2-DOX在120 h之后的释放量为26%，而pH 6.0和pH 5.0时释放量分别为42%及82%。对两种载药纳米微球而言，释放量都随着pH值的下降显著上升。pH值下降，纳米微球中氨基质子化带正电荷，阿霉素中氨基同样质子化带正电荷，两者之间静电排斥力加大，所以释放速率加快。3.4 NP1-DOX和NP2-DOX的细胞毒性试验 图8. 明胶纳米微球（NP1）和对羧基苯硼酸修饰的纳米微球（NP2） 分别与HCT细胞培养24 h（左）和48 h（右）后的细胞存活率 图9. 负载药物的明胶纳米微球（NP1-DOX）和对羧基苯硼酸修饰的纳米微球（NP2-DOX） 分别与HCT细胞培养24 h（左）和48 h（右）后的细胞存活率 从图中可以看出，NP1和NP2在与细胞共培养24 h和48 h后细胞存活率均在90%以上，说明两种空白纳米粒子均具有良好的生物相容性；Free DOX、NP1-DOX和NP2-DOX在24 h后细胞存活率都在85%以上，细胞存活率较高，这是由于HCT细胞对于阿霉素敏感度不是很高。然而48 h后，Free DOX和两种载药粒子都能有效地杀死细胞并且细胞存活率都随着药物浓度的升高而降低。两种载药纳米微球的细胞毒性都弱于自由药物阿霉素，这是因为纳米微球本身具有较好的药物缓释能力，在培养体系中缓慢释放药物，所以毒性降低。4 结论本实验以4-羧基苯硼酸修饰的明胶纳米粒子为载体，盐酸阿霉素为模型药物，制备成了负载药物的明胶纳米微球，并通过动态光衍射（DLS）粒径仪检测两种纳米粒子的粒径分布以及表面电位，并检测两种纳米粒子在生理盐水、PBS、培养基、血清和不同pH等条件中的稳定性条件下的粒径以及光强的变化以及细胞毒性和体外释放量。经过透射电子显微镜下的观察发现本实验所制备得到的两种纳米微球粒径较小，在100nm左右，形状规整，都为球形，粒径分布均一。两种纳米微球生理稳定性测试结果表明制备的纳米微球在不同的生理环境下，粒径及光强未有明显变化，说明纳米微球没有明显的聚集或沉淀，均有良好的稳定性。体外释放测定的结果显示两种纳米粒子可以顺利的释放负载的药物，且释放行为具有一定的pH响应性。而在细胞毒性试验中，空白纳米微球均未显示出任何细胞毒性，说明基于明胶制备的纳米微球具有良好的生物相容性。负载药物的纳米微球在和人结肠癌细胞HCT共培养24 h后，效果不明显。而培养48 h后，显示出一定的细胞毒性。因此，4-羧基苯硼酸-明胶纳米微球可以作为一种优良的抗肿瘤药物载体，需要进一步深入研究其体内外抗肿瘤效果。主要参考文献：1 孙林丽，龚彦铭，但卫华，等.明胶基微粒的研究进展J.皮革与化工，2010(3):22-27.2 罗阔.肿瘤靶向治疗的相关研究D.重庆医科大学.2014.3 抗肿瘤靶向药物概述J.上海医药.2009,30(12):545-550.4 Park J W. 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