ELISA基础知识及常见问题的处理.ppt

ELISA基础知识及常见问题处理,北京万泰生物药业股份有限公司 技术工程师 崔伟,ELISA（酶联免疫吸附试验）,ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种酶免疫测定。在临床检验中主要通过抗原抗体于固相或液相载体中反应检测体液中的抗体或抗原性物质。通过辣根过氧化物酶（HRP)与底物液TBM的反应指示出所检测物质的有无。 1 抗原：抗原是能在机体中引起特异性免疫应答的物质。 2 抗体：抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白。Ig分五类，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。与免疫测定有关的Ig主要为IgG和IgM。 机体被微生物感染后，先产生IgM抗体，然后产生IgG抗体。经过一段时间，IgM抗体量逐渐减少而消失，而IgG抗体可长期存在，在疾病痊愈后可持续数年之久。,ELISA检测方法,夹心法: 双抗原（抗体）夹心法是检测抗原最常用的方法，其检测方法： 双抗原夹心： 固相(包被)抗原Ag + 样品(抗体Ab) + 酶标抗原Ag* Ag-Ab-Ag* + 底物(TMB)显色 双抗体夹心： 固相(包被)抗体Ab + 样品(抗原Ag) + 酶标抗体Ab * Ab-Ag-Ab* + 底物(TMB)显色,间接法 间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。 其检测方法： 固相(包被)抗原Ag + 样品(抗体Ab) + 酶标二抗Ab* Ag-Ab-抗Ab* + 底物(TMB)显色,竞争法 其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应： 固相(包被)抗原Ag + 样品(抗体Ab) + 酶标抗体Ab* Ag-Ab + 底物(TMB)不显色(+) 固相(包被)抗原Ag + 样品(无抗体Ab) + 酶标抗体Ab* Ag-Ab* + 底物(TMB)显色(-),诊断试剂所用的质量指标及相互关系：,灵敏度：能检测到的分析物的最小量，表示检测下限的能力。 相对灵敏度=真阳性/（真阳性+假阴性）100% 测定方法及表示方法：灵敏度标准品、质控血清、阳性标本稀释终点、血清盘（pannel）及临床标本阳性率。 灵敏度标准品可以从卫生部临检中心购买，质控血清可以从卫生部临检中心购买，也可以自己配制。因为质控血清不一定是原倍血清，或由于片段、亚型、位点等原因，评定试剂盒的灵敏度都带有一定的片面性。 阳性标本稀释终点的方法常用于不同试剂盒的比较，但也有上述的片面性。阳性pannel有些可以从卫生部临检中心购买，如HBsAg阳性pannel，也可以自己配制。临床标本阳性率，是一种粗略的估计，但对临床很实用。,特异性： 真阴性标本的检出能力。 相对特异性=真阴性/（真阴性+假阳性）100% 测定及表示方法：质控血清、血清盘、临床标本阴性率。 质控血清、血清盘可以从卫生部临检中心购买，也可以自己配制。自己配制时注意阴性标本的在血清盘中的比例以及代表性。临床标本阴性百分率是临床使用中对试剂盒特异性的粗略的判断。 如果数批产品都通过了特异性参比测定，是否产品的特异性就一样了呢？不一定。因为特异性参比品的数量不可能很大（样本与整体的差异），引起非特异性的因素很多，目前尚不完全清楚。质控血清盘也存在同样的问题。,有关名词简介,质控血清：质控血清是为了对实验结果进行控制而配制的血清。质控血清可以是定值也可以是不定值，可以购置也可以自配。自己配制时要注意选用无脂血的血清或血浆，不能用试剂盒内的阳性对照。若用稀释的血清作为质控血清，应考虑稀释基质成分对结果的影响。因质控血清与临床标本不一致，应该注意对结果的分析，应该注意质控血清只能用于质控活动，不可用于标定仪器或评价方法。用于室内质控的质控血清一般选取CUTOFF值2-3倍的质控品。,室内质控：实验室内部使用控制实验结果可靠性的一种质量控制。 室间质评：用于考核各个实验室结果可靠性的一种考核，可分为国家级和地方级的室间质评。可以理解为 “各个实验室的质量评比”。,临界值（CUTOFF值）：临界值是判断阴阳性或有临床意义水平的数值，临界值的确定是测定大量数据后应用统计学方法确定的。许多试剂都会给出临界值或临界值的计算方法。 本底：就是底色。如ELISA HBsAg，阳性显色，阴性不显色，本底就是整个阴性显色的情况。ELISA 抗HBcAb，阳性不显色，阴性显色，本底就是整个阳性显色的情况。,阴性对照及阳性对照：阴、阳性对照若有正确的结果，对试剂盒操作的结果可以有粗略的判断。 空白对照：对ELISA试剂来说，空白对照实际上是不加标本不加酶做对照。空白对照主要测系统的吸光率。空白对照在单波长测量时显得尤其重要。,ELISA 试剂常见问题及解答,ELISA试剂的原理基础为抗原抗体免疫反应，在生产、储存、运输、使用等各环节中，对其质量特性产生影响的因素众多。此外，其显色系统中的过氧化物酶在生物样品中普遍存在，故在客户使用过程中经常会产生某种非期望的