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本科生课堂论文题目：分子进化研究问题探讨姓名： 分子进化研究问题探讨摘要 进化的研究在生物学中占有重要的地位。生物进化包括表型进化和分子进化，有自然选择理论和中性理论，这两个理论构成了现代进化理论(modern synthetic theory of evolution MET)。本文重点介绍分子进化中性理论以及建立在中性理论上的分子钟问题。如今，中性理论与分子假说越来越多的被学者接受。关键字 分子进化；中性理论；分子钟Abstract Evolutionary research plays an important role in biology. Biological evolution, including the evolution of phenotypic and molecular evolution,natural selection theory and Natural Theory of Molecular Evolution,which constitute the two theories of modern evolutionary theory (Modern Synthetic Theory Of Evolution MET). This article focuses on the neutral theory of molecular evolution and the establishment of the Theory of Molecular Evolution of molecular clock problems. Today, the neutral theory and the molecular clock hypothesis more and more accepted by scholars.Keyword Molecular Evolution; Theory of Molecular Evolution; Molecular Clock前言 生物进化包括表型进化和分子进化，有自然选择理论和中性理论，这两个理论构成了现代进化理论(modern synthetic theory of evolution MET)1。最初认定生物进化为事实的是法国的生物学家拉马克(J.B,Lamarck)，众所周知，由于达尔文和华莱士(A.R.Walla-ce)提倡的自然选择理论而开辟了科学地说明生物进化特别是适应性进化的道路2。尤其是达尔文在物种起源中运用了丰富的资料表明，分类、地理分布、发育、形态、古生物等很多领域中已知的事实，要是没有进化的观点就不能加以说明。更为重要的是，达尔尔确立了作为进化的主要因素的自然选择理论。这个理论宣传生物界中普遍地存在着生存斗争，变异无处不有，许多变异是遗传的，作为当然的结局，那些具有对生存哪怕稍许有利变异的个体会留下更多的子孙，并且那种有利的变异能遗传给下代，于是生物随着岁月的推移就朝着适应环境的方向逐渐地变化下去。 达尔文以后经历约一百年的进化的研究只限于表型水平的变化，只要是关于表型水平的变化，达尔文的自然选择学说就一直取得了极好的成功。但是，用选择说明进化中的所有变化则大概是过分了。在分子进化的研究不断地揭露出新事实，表明了近于自然选择万能论的进化综合理论有必要重新考虑。另外，搞清楚了自然选择不是直接作用于基因，而是通过基因产生的蛋白质的立体结构及其机能起作用的，也搞清楚了基因的重复对于新基因的出现是必需的 关于进化与变异的研究迎来了一个大的变革时期。中立学说(详细地说为中立突变漂变假说neutral mutation一random drift hypothesis)是作者木村资生为了定量地说明上述观察到的事实，在1968年提出来的。由于中立学说和以往的进化机制论和群体遗传学中的曾经成为主流派的把自然选择看成近于万能的观点(称之为新达尔文主义或进化的综合理论)不相容，而掀起了世界性的激烈争论，中立学说遭到了很多批封与攻击。但是，近几年来积累了许多对中立学说有利的证据，中立学说不仅生存了十年以上，而且理论性基础也巩固起来了。他提倡中立学说的直接契机是基于分子进化速度的数据2。1 分子进化中立学说 中立学说主张的根本点在于认为进化过程中基因内部的变化与其说由于受自然选择还不如说主要是受突变及遗传漂变的支配。可以认为在所有的生物群体之内都经常发生着迄今未曾料想到的那样大规模的遗传漂变。这种巨大的随机漂变流，据我们人的一生的尺度来衡量的话，几乎是看不出的那样缓慢，可是随着岁月的流逝，它是非可逆地积累下去，在以地质年代为尺度计算的漫长年代之后，就会使种的遗传组成发生一个大变化。中立学说和达尔文的自然选择学说不是对立的，在理解生物进化方面应该把中立学说看作是应付加到自然选择学说中的一个原理2,3,4,5。 1.1 分子进化与表型进化分子进化有五大特征：(l)对每种生物大分子来说，只要分子的三级结构和功能基本不变，那么，各进化路线以突变替换表示的进化速率大致保持每年每个位置上恒定，(2)机能较次要的分子或分子片段的进化速率，高于机能较重要的分子或分子片段的进化速率；(3)在进化过程中，使分子现存结构和功能破坏较小的突变比破坏较大的突变有更高的替换率，（4)基因重复通常发生在一个具有新功能的基因出现之前多(5)明显有害突变的选择清除租选择上中性的或轻微有害的突变的随机固定，比明显有利突变的正达尔文选择更为频繁6。分子进化与表型水平的进化之间差异很大。表型水平的进化主要有三点，即物种的多样性，进化速度的差异性和进化的适应性。三者之中最本质的还是进化的适应性，自然选择说和中性说之所以对于生物的进化机制得出不同的结论，是因为两个学说分别是着眼于生物的不同层次。找到了沟通分子层次和表型层次进化的桥梁，即存在于生物各层次中的结构和功能的可塑性以及相应的调节机制，也就可以在新的基点上将自然选择说和中性说统一起来了。中性说不但不是非达尔文主义，相反它进一步在分子水平上丰富和完善了达尔文主义，并使我们看到了生物在不同层次进化的多元模式，而不同的模式又可相互协调地共存于高度复杂的有机体中，它使人类对有机界进化规律的认识更加深化，更臻完善7。 1.2中性学说的意义及其局限性 中性学说认为，自然界大多数物种的有效群体大小是有限的，就大多数突变来说，往往与自然选择的关系不大(因为一般而言选择强度都是很小的)，即突变呈现中性.也就是说，突变的命运由随机漂变所固定或淘汰.太田(日本学者Ohta)认为轻微有害的突变为近中性，从而延伸了中性突变的范围.对中性突变来说，在相当长的进化时期，往往呈现近似分子钟(molecular evolutionary clock)的特征.据此分子进化学家以不同物种的同源基因或同源基因产物为材料，利用计算机程序重建系统树，以决定这些物种间亲缘关系或演化规律.这对同一物种不同群体亲缘关系的分析更有成效。中性学说富有成效地在分子水平上揭示和解释极为丰富的遗传多态性，它是以分子进化动态过程中“相”这个概念出发，从演变历史角度来解释遗传多态性的。 除了中性突变加上随机漂变导致不同物种或同一物种不同群体的同源基因不断演化外，中性学说还认为进化的重要分子机制在于基因重复，如肌红蛋白和血红蛋白、血红蛋白。和日链、珠蛋白家族，以及tRNA和rRNA基因的协同进化等等8。诚然，基因的重复作为进化机制已获公认。长期进化研究中，为维持匹配序列间最大同源性，常常会人为地制造许多空隙.事实上，此时匹配序列会有自然插缺(一序列的插入相当于另一序列的缺失，反之亦然)。空隙与插缺在估算系统树时难以区分，使分子中性学说局限于对中、短期进化的研究，其边界一端是长期进化9。宏观进化的灾变学说和点断平衡论指出图，长期进化中灾变是突然发生的，中性学说难以在微观水平上予以说明，究其原因是中性学说属于线性范畴之故。同样，中性学说对种化这个极重要问题也因同一原因而无能为力。中性学说的提出者声称自己所揭示的进化为“非达尔文式进化”。人们常常将与以自然选择学说为核心的进化论有分歧的理论称为“非达尔文主义”。但是， 分子进化的研究表明， 分子的功能决定了选择意义和选择强度，中性进化和选择驱动的进化是相对的10。因此中性理论是自然选择理论在分子水平上的补充和发展， 是达尔文创立的科学进化论向微观的深入9；而表型进化则更多地符合自然选择规律。科学不畏挑战。达尔文进化论及其相关研究历经百余年的发展， 取得了光辉的成就，但依然面临着一些悬而未决的问题， 等待有志于此的科学家去探索、去发现11。 1.3 中性突变(Neutral mutation)对于一个密码子来说，由于核苷酸的替换可发生在三联体的任一位置上每个位置都有三种突变及同义突变、变义突变、无义突变。 错义突变（missense mutation）：碱基对的置换使mRNA的某一个密码子变成编码另一种氨基酸的密码子的突变称为错义突变。错义突变可导致机体内某种蛋白质或酶在结构及功能发生异常，从而引起疾病。 无义突变（nonsense mutation）：某个编码氨基酸的密码突变为终止密码，多肽链合成提前终止，产生没有生物活性的多肽片段，称为无义突变。这种突变在多数情况下会影响蛋白质或酶的功能。 同义突变（same sense mutation）：碱基置换后，虽然每个密码子变成了另一个密码子，但由于密码子的简并性，因而改变前、后密码子所编码的氨基酸不变，故实际上不会发生突变效应。故突变前后的基因产物（蛋白质）完全相同。同义突变约占碱基置换突变总数的25。 每个密码子的第三个位置的突变通常是同义突变，而大多数的突变都是同义突变也就是密码子中的碱基发生置换表达产生的氨基酸与原来的一样这就叫做中性突变。突变大多是“中性”的，它不影响核酸和蛋白质的功能，对生物个体的生存既无害处，也无好处。中性突变(Neutral mutation)在自然群体中发生随机遗传漂变， 而自然选择对其不起作用。中性学说表明， 分子水平上的进化至少有一大部分不符合自然选择学说，表现为非“达尔文式进化”。事实上， 功能重要的生物大分子或大分子的一部分随生物生存能力的强弱而被选择(功能约束现象)， 这与自然选择的作用渠道相关；功能不重要的生物大分子的一部分体现为遗传漂变(Genetic drift)驱动的中性进化。突变的产生既有随机的一而，又有决定论的必然性的一而。中性突变也一种基因突变，它的产生同一般突变一样是偶然性和必然性共同决定的。并且，中性突变的性质本身也是由必然性决定的。它们都是无功能结构中的突变，并且以保持这种对生物的无用性为条件，只要在这种条件下，在这种范围内，它们无论怎样突变都是严格中性的。另一类是木村资生提出的“选择上等价的”中性突变，所谓“选择上等价”是指所产生的突变同被取代的基因在适应性上等价。基因A突变为B、只有B在功能上的有利性同A等价，这种突变才是木村意义下的中性突变。同义密码子之间的互变是中性突变，这是因突变前后所编码的氨基酸种类不变。所以，这种中性突变，实质上是有利突变的另一种存在方式。总之，基因突变(包括中性突变在内)并不是“纯粹的偶然性妙、“绝对自山的”。突变发生的随机性和自由度都是相对的、受必然性制约的12。 由于中性突变是没有功能，或者是选择上，即功能上等价的，所以，它们留存之后的行为有很大特殊性，这就是木村资生特别强调的随机漂移现象。可是，中性突变只是种群中发生的几种突变中的一种，另外还有有利突变和有害突变。它们中的每一种，可能单独发生，也可能以不同的组合同时发生。因此，中性突变的扩散或消失，不可能如木村主张的完全是偶然的、随机的过程，其主要模式，至少有以下四种13：第一，“搭载效应”。T.杜布赞斯基指出：“一个基因在进化上的命运，是决定于它对基因型总貌，的总适应值的效果”，“中性的，甚至轻微有害的性状，假使它们是和有用的性状联系在一起的话，也可能因为选择而受到促进。”在这里，每年以一定速率发生的中性突变是产生在总适应值较大的个体中，还是发生在别的个体中，是随机的、偶然的。但是，突变基因，包括中性突变，它们在种群中的扩散是通过繁殖实现的。而繁殖是在自然选择制约下实现的。繁殖力的强度是生物对环境适应程度的主要表现。对有性生殖来说，其第一步是交配，第二步才是随机性很大的受精过程。而交配的实现，在许多种群中要经过激烈的性选择，在这样的种群中，产生在总适应值较大个体中的那些中性突变，会随着这些个体在性选择中的胜利而随之扩散。相反，产生在总适应值较小个体中的那些中性突变，就会随着这样的个体的失败，甚至被淘汰而不能扩散，或者随之消失。这就是所谓搭载效应，或者乘车效应。搭载效应使中性突变的扩散或消失有了必然性。第二，只有中性突变发生，并且发生在总适应值同其它个体基本相同的个体(生殖细胞)中，或发生在随机交配的种群中，在这种特定情况下，在交配和受精过程中没有选择压力发生，其扩散或消失完全是随机漂移过程。第三，假中性突变同有害突变同时发生在种群不同个体(或配子)中时，其发生后的行为受自然选择推动。例如，一个配子(个体)携带有假中性突变，另一个配子(个体)携带有有害突变，在这种情况下，前者得到留存和扩散，后者则是淘汰的对象。第四，在随机交配的小种群中，由于缺乏竞争者，生存斗争比较缓和，选择压力较小，因此，可能使总适应值较小的个体，由于偶然的机遇而取代了总适应值较大的个体，并在种群中扩散和固定。发生在这样的个体中的中性突变也会随之扩散和固定。 1.4 近中性理论 近中性理论： Ohta(1992)在中性理论基础上提出分子进化的近中性理论(nearly neutral theory of molecular evolution)，认为近中性突变作为一种突变效应的随机涨落，形成一些弱的具有正向或负向适合度效应(或选择系数)的突变，在特定机制作用下可能被放大而突破选择瓶颈， 从而产生形态或功能进化的后果，以接受自然选择的作用。近中性理论认为轻微有害的边界性突变在氨基酸置换中可能很普遍。如果近中性突变在新突变中占相当比例， 则近中性理论对进化和多态速率的理论预测就与中性理论预测不同； 最重要的是进化速率与物种的种群大小之间存在负相关关系； 而对于中性突变， 进化速率与种群大小是无关的。近中性理论作为中性理论的一个改进， 可以解释的现象更为广泛14。2 分子钟 因此进化的速率被视为进化研究中的基本问题之一。进化速率( Rate of ev olution ) 被定义为“在某一段绝对时间内的遗传改变量”， 这是较早的进化速率的概念。而与分子进化速率相关的分子钟的概念则源于对蛋白质序列的研究。Zucker kandl 和Pauling( 1962， 1965) 及Marg oliash ( 1963) 在比较了几种动物的血红蛋白、细胞色素C 的序列后最先注意到： 这些蛋白质的氨基酸取代速率在不同的种系间大致相同， 即分子水平的进化存在恒速现象15。于是， Zuckerkandl 和Pauling 提出了进化在分子水平存在“时钟”。若用公式表示分子钟的概念， 则首先需要根据化石、生物事件及性状的成对距离比较来确定物种分类单元同源序列( 包括蛋白质序列或氨基酸序列) 最近的分歧时间， 然后比较同源序列的氨基酸或核苷酸取代数目， 就可以计算出此分类单元的平均氨基酸或核苷酸取代速率，即：r = K/ 2T ，其中r 为氨基酸或核苷酸取代速率； K 为两同源序列的氨基酸或核苷酸取代总数； T 为物种间的分歧年代(图1) 。此时， 若我们认为得到的平均取代速率基本是恒定的， 我们称这个恒定取代速率为分子钟。他们认为，生物的分子进化过程中普遍存在有规律的钟，即分子进化速率近似恒定。因此，分子钟假设成立的先决条件是对于任意给定的大分子(蛋白质或DNA序列)在所有进化谱系中的进化速率近似恒定的。虽然一些传统分类学家对基于分子钟概念的分子系统学提出了质疑，认为目前分子系统学是对众多并不真实反映自然发生的分子变异量的分析，也就是在对虚拟的自然过程进行的分析和检验，但这个假说仍然激起了科学家利用大分子研究进化问题的极大兴趣。原因有二：首先，如果大分子进化速率恒定，就可用来测定物种分歧时间和其他类型的进化事件，这类似于利用放射性同位素定地质年代。而且，速率恒定条件下重建系统发育关系也比速率不恒定条件要简单得多。另外，谱系间变异速率的程度对分子进化机制的研究提供更多的观点15。分子进化改变量(替换数或替换百分率)与分子进化时间呈正比。由已知的资料可以获得分子进化改变量进化时间的对应曲线，并用它来推断未知进化事件发生的可能时间。根据分子钟假设，可以通过基因序列间的分歧度及序列的平均置换速率来估计速率恒定分支间的分歧时间，这一间接时间数据可与化石记录所反映的直接数据进行比较。因此，分子钟研究为探究化石生物类群的分歧时间提供了一个新的途径，不仅可用来对基于化石记录的传统结论加以验证，同时对于化石记录不完整的生物类群的起源历史的推测具有特殊意义。分子钟研究为人类学家、生物学家和古生物学家的工作提供了一套丰富而独立的结果15。 分子进化的速率不仅恒定，而且惊人地高此外，用自然选择说解释分子进化，还存在无法负担“自然选择代价，和分离负荷，以及必须假定有高得不合理的“有利突变率”的矛盾。中性学说只是说分子水平上的大多数突变是中性的，并没有说全部突变都是中性的.分子进化的速率对同一种分子来说保持恒定，而不同分子却各不相同.机能较次要的分子或分子片段的进化速率，高于机能较重要的分子或分子片段的进化速率16。 分子钟假说为我们推导生物起源时间提供了一条新的思路和途径。进化是整个生命科学研究的核心和灵魂，而早期的生命演化在生物进化过程中具有重要地位，是科学界研究的前沿和热点问题。基于生物的遗传距离所建立的分子进化速率，可用于进一步推测不同生物类群在进化历史上的分歧时间。这一间接时间数据可与化石记录所反映的直接数据进行比较。分子钟研究为探究早期生命演化提供了一个新的途径，不仅可用来对基于化石记录的传统结论加以验证，同时对于化石记录不完整的生物类群起源历史的推测具有特殊意义。然而，利用分子钟方法所得出的不同门类起源时间总是早于化石记录，因此分子钟与化石记录的矛盾仍十分突出。文中综述了基于化石证据研究后生动物起源、寒武纪生命大爆发及被子植物起源等早期生命演化的研究进展，介绍并分析、讨论了分子钟方法及利用分子钟研究早期生命起源时间问题及其与化石记录间的矛盾，同时认为古DNA的证据有利于分子钟的校正17。 2.1 分子进化的大体趋势尽管分子进化速率受到上述各种因素的干扰，例外的现象不断出现，但分子进化呈现下述的一些趋势：1)就DNA分子而言，非编码区的进化速度普遍要快于编码区的；2)就某个基因而言，其进化速率与其功能重要性直接相关。一般地，具有重要功能的基因进化速率相对会慢一些；反之则较快；3)就同一基因的不同区段而言，重要密码子的进化速率要慢于相对不重要的密码子；在编码区发生的碱基替换未达到饱和前，同义突变的速率要快于异义突变的；4)就物种而言，一般来说，人们发现：进化速率由哺乳类-鸟类-两栖类-鱼类呈递减趋势。 2.2应用分子钟假说的一些简要原则(1)选择数量适合的分类元。在估算分子进化速率时，通常倾向于使用较多的分类元以求找到较多的变化；但增加过多的分类元会因趋同进化的可能性增加而导致检出的变化减少，从而得到进化速率比实际慢的分子钟，那么用之于估算物种分歧年代时就会发生错误，因此并非使用的分类元越多越好；(2)避免使用有不同进化背景(如网状进化、水平迁移及支序分歧等)的性状，同时也应考虑包含进化信息的同源性状，即不采用没有变化或者由趋同进化得到的非同源性状，而应采用包含了较好的进化信息的性状，如线粒体基因组中的细胞色素B基因和ND4基因为包含有良好发育信息的基因；同时还要根据研究的分类阶元的高低来选择采用进化上相对保守的序列还是进化相对快的基因；(3)考察所选取性状的进化速率是否相同。由于在估算分子钟时需要假设： 1)所选取的成对距离比较的性状间的分子进化速率不随分类单元的不同物种而改变； 2)化石的或着生物地理的证据需准确反映种系分歧的时间18。对于假设1，由上述引起分子异速进化的因素的讨论可见，不同物种可能有并不相等的进化速率；而对于假设2，我们也难辨其真伪。因此为避免这个问题我们建议在得到序列后，先考察选取性状在不同分类元间的相对进化速率，然后再考虑是否采用需分子钟假设的方法来构建分子系统树；(4)在估算分子钟或在重建物种系统发育关系时往往要采用多个基因，我们不可避免地要处理从不同基因得到的进化信息，但是由于影响各个基因进化的不同因素的存在，我们还需考虑各个基因由于如替代类型(如转换与颠换)发生的概率不同、核苷酸的组成比例差异等而造成的干扰，目前，可采用最大似然法及似然机率来估算可能的权值来处理，以消除各种干扰；(5)在建立系统发育树、估计进化速率和物种分歧时间时，通常需要参考其它的生物学证据，如古生物、生物地理及形态学的证据，目的在于建立正确的物种发育关系。但是在综合这些证据时，应特别小心，因为各种证据可能是基于不同的标准，有可能得出相互矛盾的结果，举例来说，在估算鸟类分歧年代方面就存在矛盾。(6)比较而言，灵长类的化石记录较完全，分子方面的数据也较为丰富，适当地，可选择有关的分子钟作为参考。正确地估算与应用分子钟，对于我们充分利用分子水平的进化信息，探寻分子水平的进化规律，了解物种分子水平的进化过程有重要意义。当今各种争论也正激烈，我们将密切关注各方面的进展。小结本文就分子进化问题上探讨了分子进化假说以及分子钟问题并给出建议。分子进化研究有助于进一步阐明物种进化的分子基础，探索基因起源机制，从基因进化的角度研究基因序列与功能的关系。参考文献1 Hu T B, Long M P, Yuan D J, et al. The genetic equidistance result： misreading by the molecular clock and neutral theory and reinterpretation nearly half of a century later. Sci China Life Sci, 2013, 56： 254261, doi: 10.1007/s11427-013-4452-x2 分子进化的中立学说。木村资生著庚镇城译1968年3 Kimura M,The Neutral theory of molecular evolution Cambridge University Press(1983)4 Kimura M. Evolutionary rate at the molecular level. Nature, 1