碱性蛋白酶改性豌豆蛋白的起泡性能研究毕业论.doc

碱性蛋白酶改性豌豆蛋白的起泡性能研究摘 要植物蛋白在近些年新食物产品中和传统食品中的应用，使得植物蛋白得到了大量的关注和研究。为了研究食品原料的理化性质和功能特性，必须对植物蛋白进行研究评估。由于蛋白质食物的紧缺，人们开始需求新的植物蛋白资源作为功能性食品配料和营养补充剂使用。试验研究了以Alcalase 碱性蛋白酶改性豌豆蛋白起泡性能,分析了温度、pH 值、底物浓度、酶与底物浓度比和时间对酶水解的影响。通过均匀设计和统计分析建立了酶水解的数学模型,并以此模型得到Alcalase 碱性蛋白酶改性豌豆蛋白起泡性能的最佳水解工艺。工艺参数为加酶量0.16%、时间30min、PH8.00、温度55、底物浓度8%。关键词： 碱性蛋白酶；豌豆蛋白；起泡性能；Title The study of alkaline protease modified pea protein aboutfoaming properties AbstractThe use of plant proteins in the formulation of new food products, or in conventional foods, has been the focus of much research in recent years. In order to develop plant proteins for use as food ingredients, their physicochemical and functional properties must be evaluated. Because of inadequate supplies and shortage of food proteins, there has been a constant search for unconventional legumes an new protein sources for use in both functional food ingredients and nutritional supplement.The preparation techniques of pea protein by Alcalase were studied. Through statistics and analyses,the effects of pretreatments, temperature, concentrations of substratum, proportions of enzyme to substratum and time on enzymic hydrolysis were studied. Through uniform designs and statistical analyses, a mathematical model was set up. Based on this model, the optimum hydrolysis conditions were determined:55,PH8.0,substratum concentration 0.16%,proportion of Alcalase to substratum8%,enzyme time 30min.Keywords： Alcalase; pea protein; foaming property; 1 引言- 4 -1.1 本课题研究的目的和意义- 4 -1.2国内外研究现状- 5 -1.3 主要研究内容- 5 -1.3.1 酶解对蛋白质的影响- 5 -1.3.2 蛋白质的起泡性与泡沫稳定性- 5 -1.3.3 蛋白质改性的两大技术与优缺点- 6 -1.3.4蛋白质的功能特性与结构的关系- 6 -1.3.5 蛋白质泡沫的定义与影响因素- 6 -2 实验材料和方法- 7 -2.1 实验材料- 7 -2.1.1 主要实验材料与试剂- 7 -2.1.2 主要实验仪器- 7 -2.2 实验方法- 8 -2.2.1基本组成成分的测定- 8 -2.2.2 碱性蛋白酶酶解豌豆蛋白粉- 8 -2.2.3 起泡性的测定- 9 -2.3 实验设计- 9 -3 实验结果与讨论- 9 -3.1 单因素结果与分析- 9 -3.1.1 加酶量E/S(W/W)- 9 -3.1.2 底物浓度- 10 -3.1.3 酶解时间- 11 -3.1.4 温度影响- 12 -3.1.5 PH影响- 12 -3.2 响应面实验设计与结果- 13 -3.2.1 实验结果回归分析- 14 -3.2.2响应面实验优化分析与结果- 16 -致 谢- 21 -参 考 文 献- 22 -1 引言1.1 本课题研究的目的和意义 在近几年中，植物蛋白质在新的食品或者传统食品构成中，都得到重视和研究1。我国人口众多，蛋白质资源不足，充分利用农副产品加工工业中的大量副产物作为新蛋白质资源进行开发加工制成有价值的产物，已成为一项解决我国蛋白质资源不足的长期战略任务2。蛋白质由于是氨基酸组成的，供人体生长，提供食品的功能特性，所以是必不可少的食物成分3。但由于大多数豆类蛋白质的分子量大，分子内部结构复杂，使得豆类蛋白的消化率远不及牛奶等动物蛋白4。随着国民经济的发展及膳食结构的合理化，不断应用新技术改造食品传统加工工艺已成为势不可挡的局面5。植物蛋白质资源的综合开发利用一直是蛋白质利用研究的重点6。基于消费者对安全的考虑和饮食文化，蛋白质工业向植物蛋白转变7。因为在食品和非食品领域都有需求，植物蛋白产品正在蓬勃发展8。食品趋势中更多的局限于大豆蛋白仅仅是因为关于其它植物蛋白研究的较少9。为了深度开发豌豆蛋白质资源和提高产品附加值，豌豆蛋白质功能特性的研究显得十分必要。豌豆经分离去除淀粉后，残夜浓缩后得到豌豆蛋白质，它具有很高的营养价值，蛋白质含量在63%-68%之间，氨基酸含量大于60%，具有较高的消化吸收率（大于80%），作为食品添加剂可替代部分肉蛋白用于食品加工中，如火腿肠，香肠等加工中10。蛋白质改性的发展方向主要为采用新的酶类在分子层面改性修饰蛋白质，强化某些需要的特性，以获得具有特殊功能的专用型蛋白质11。蛋白质的起泡性质是食品所需的一个非常重要的功能特性，搅打或起泡过程，包括气泡在固相或半固相中的分散及稳定，可以是食品材料中产生气孔结构，是食品加工过程中的一个单元操作。起泡操作一般用于制作轻质食品，并通过改变内聚力及柔韧性等方面来改进食品的表观及质地，起泡操作利用零成本的空气作为原料，已经制作出了很多适合消费者选择的食品，食品的起泡性质不仅取决于气体膨胀率及泡沫大小分布，还与气泡的微观结构及主体与气相界面组分的分散度有关12。蛋白质的功能性质一般是指能使蛋白质成为人们所需要的食品特征而具有的物理化学性质，即对食品的加工，贮藏，销售过程中发生作用的那些性质，这些性质对食品的质量及风味起着重要的作用，蛋白质的功能性质与蛋白质在食品体系中的用途有着十分密切的关系，是开发和有效利用蛋白质资源的重要依据。因为食品加工影响食品的功能和营养，选择先进的技术和条件研究蛋白质在是必须的13。蛋白质分子构想作用力包括氢键，疏水作用，二硫键以及静电相互作用等14。蛋白质的功能性质可分为水化性质，表面性质，蛋白质-蛋白质相互作用的有关性质三个主要类型，主要包括有吸水性，溶解性，保水性，分散性，黏性和粘结性，乳化性，起泡性，凝胶作用，调色性。1.2 国内外研究现状目前，豌豆蛋白质提取以及功能特性研究的文献报道较少，陈宝江等人研究了豌豆蛋白作为饲料蛋白源的可行性，为了更好的利用豌豆蛋白质和提高产品附加值，豌豆蛋白质功能特性的研究显得十分必要。本实验首次从蛋白酶浓度，底物浓度，酶解时间，温度，PH等方面对豌豆蛋白质起泡性（FAI）和泡沫稳定性（FSI）两个方面进行系统研究。 1.3 主要研究内容1.3.1 酶解对蛋白质的影响 酶解主要引起蛋白质三个方面的变化：1极性基团如氨基和羧基数目增加，从而使蛋白质与水的作用得以加强；2多肽链平均分子量降低；3蛋白质分子构想发生变化。这三个作用均有利于蛋白质在水中的溶解。1.3.2 蛋白质的起泡性与泡沫稳定性蛋白质的起泡性包括气泡能力和泡沫稳定性，其中起泡能力是指蛋白质在加工中体积的增加率，即形成泡沫的能力，而泡沫稳定性是指泡沫产生后的稳定能力，即泡沫的寿命，溶液起泡的主要机理是因为液相表面张力的降低，蛋白质类起泡剂能降低表面张力的能力有限，但是它可以形成具有一定机械强度的薄膜，这是因为蛋白质分子之间除了范德华力外，分子中的羧基与氨基之间有形成氢键的能力。生成的这种膜能够有效降低液相的表面张力，从而形成稳定的泡沫。不过蛋白质溶液要形成气泡，还首先应充分溶解蛋白质，使到达气泡表面的蛋白质浓度提高，这样才能最终使膜生成。蛋白质的起泡性与蛋白质浓度，PH值及温度有关，比如大豆蛋白，以偏碱性的PH值为有利，一般最佳发泡温度为30摄氏度。如大豆分离蛋白丰富的性能和品质，所以其在食品组成中更有研究吸引力15。脂质的存在对蛋白质的起泡有不利的影响，而糖类则可提高粘度，增加泡沫的稳定性。常见的蛋白质的功能特性改善技术有：物理改性，酰化作用，磷酸化作用，脱氨基作用，糖基化作用，共价交联作用，蛋白质水解作用。物理改性是利用加热，机械作用，高频振荡等方式来改变蛋白质的物理性质16。1.3.3 蛋白质改性的两大技术与优缺点 蛋白质水解作用又可以分为非酶法和酶法两大类，非酶法是最常使用的改性技术，由于其反应简单，应用广泛和效果显著的特点而倍受欢迎，但是非酶法也存在着反应条件苛刻，试剂专一性不强，最终产品中出去未反应试剂较困难等不足之处，酶法改性已有了很大的发展，酶促反应速度快，条件温和，专一性强，更重要的是一些低廉生物酶的出现，酶法反应通常为湿法反应，生产成本高17。但是不破坏氨基酸结构，产生有害物质的可能性小，安全性高，水解产物是小分子肽和氨基酸，易为人体消化，吸收，也更适于食品加工领域的应用18。1.3.4蛋白质的功能特性与结构的关系豆类蛋白的功能特性与其结构有关，即氨基酸组成，排列顺序，构象，分子的形状和大小，电荷分布以及分子内和分子间键的作用，高比例的极性残基影响肽链间相互作用，水化作用，溶解性和表面活性，疏水性相互作用在在蛋白质三级折叠中相互作用，影响乳化作用，起泡性和风味结合能力，带电氨基酸能增强静力相互作用，起到稳定球蛋白，巯基能被氧化形成二硫键，硫醇和二硫化物的相互转化会影响流变特性，共价键和非共价键的性质和数量决定了蛋白质的大小，形状，表面电荷，所有这些性质又受PH，温度等环境因素及加工处理的影响。1.3.5 蛋白质泡沫的定义与影响因素蛋白质的泡沫主要由蛋白质溶液包裹着的小气泡群体组成，溶液受到急速的机械搅拌时，有大量的气体混入，形成许多水-空气界面，蛋白分子吸附到这些界面上，降低界面张力，促进界面形成，所谓的稳定性，就是指泡沫形成以后能保持一定时间，并具有一定的抗破坏能力。所以蛋白质可否作为良好的起泡剂取决于以下两个方面的能力，即蛋白质迁移至界面的速率和其形成稳定膜的能力19。最后在稳定的泡沫体系中，蛋白质多肽链相互作用缔合形成连续的分子间聚合物，包围空气泡。此泡沫是由液态连续相包裹空气分散相所形成，PH值，能量供应和溶质的存在都会影响蛋白的起泡能力20。2 实验材料和方法2.1 实验材料2.1.1 主要实验材料与试剂豌豆蛋白粉:山东健源食品有限公司。碱性蛋白酶：Alcalase 2.4L FG，诺维信中国投资有限公司。 十二水合磷酸氢二钠（分析纯），柠檬酸（分析纯）。2.1.2 主要实验仪器箱式电阻炉 SX-2.5-10 型 上海实验电炉厂全自动定氮仪 2300 福斯特卡托公司（瑞典）电子分析天平 AY-120 日本岛津制作天平所磁力加热搅拌器 78-1 江苏省金坛市医疗仪器厂电热恒温水浴锅 HH-S 北京中兴伟业仪器有限公司精密PH计 PHS-3C 型 上海精密科学仪器有限公司雷磁仪器厂电热鼓风干燥箱 101 型 北京市永光明医疗仪器厂恒温振荡器 CHA-S 金坛市华峰仪器有限公司离心机 LDA-2 北京医用离心机厂高速切乳化机 FA25 上海弗鲁克液体机械制造有限公司2.2 实验方法2.2.1基本组成成分的测定水分含量的测定:按GB 5009.32010直接干燥法测定灰分含量的测定:按GB 5009.42010灼烧称重法测定粗脂肪含量的测定:按GB 5009.5-2003索氏抽提法测定粗蛋白含量的测定:按GB 5009.52010凯氏定氮法测定缓冲溶液的配制如下：表一 磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液（1/15mol/L）的配制pH1/15mol/L Na2HPO41/15mol/LKH2PO44.920.109.905.911.009.006.986.004.008.049.500.5008.9810.001/15mol/LNa2HPO4的配置：取23.876g Na2HPO412H2O溶于蒸馏水后定容至1000mL；Na2HPO412H2O 分子量=358.14。1/15mol/LKH2PO4的配置：取9.073g KH2PO4溶于蒸馏水后定容至1000mL；KH2PO4 分子量=136.09。豌豆蛋白的基本成分组成表二豌豆蛋白粉的基本成分组成及含量（%）总蛋白粗脂肪水分灰分氮溶指数76.381.646.005.8623.682.2.2 碱性蛋白酶酶解豌豆蛋白粉采用碱性蛋白酶(Alcalase) 对豌豆蛋白进行酶解，准确称取一定量的豌豆蛋白粉于锥形瓶中，加入一定pH的缓冲溶液，放入事先调好温度的恒温振荡箱中振荡溶解20min；按一定的酶与底物质量之比（E/S）添加酶，在恒温振荡器中酶解一定时间；将锥形瓶置于沸水中灭酶10 min，自来水冷却；定容，离心(4000 r/min，10 min)，取上清液待用。2.2.3 起泡性的测定用移液管量取上清液20mL于100mL小烧杯中，用高速切乳化机以10000r/min的速度搅打2min后立即转入量筒中，分别记录0min时和30min后的泡沫体积V1和V2，按下式计算:起泡能力=均质停止时泡沫体积(V1)/搅打前液体体积100%泡沫稳定性=均质停止后30min泡沫体积(V2)/均质停止时泡沫体积(V1)100%2.3 实验设计采用碱性蛋白酶水解豌豆蛋白，探讨加酶量、酶作用时间、底物浓度、酶作用温度、pH对豌豆蛋白起泡能力及泡沫稳定性的影响。在单因素试验的基础上，利用响应面分析法(response surface methodology，RSM)中的Box-Behnken软件对水解条件进行优化，进一步研究各个因素及其交互作用对豌豆蛋白起泡能力及泡沫稳定性的影响，建立响应面模型的回归方程并对每一个系数的显著性进行统计分析。3 实验结果与讨论 3.1 单因素结果与分析3.1.1 加酶量E/S(W/W)底物浓度4%，30min，50，pH8.0的前提下，采用0.00%，0.04%，0.08%，0.12%，0.16%，0.20%的酶浓度，在底物浓度、酶解温度、pH 值等其它因素不变的情况下，增大碱性蛋白酶用量增加，豌豆浓缩蛋白的起泡能力及起泡的稳定性逐渐增加，当加酶量达到0.16%时，起泡性与泡沫稳定性达到最大值，随后开始慢慢减小。这可能是由于有限酶的催化水解使蛋白质分子柔性增加，疏水基团充分暴露，因而使蛋白质分子能迅速吸附至气水界面，并随即将界面张力下降至低水平能力，增强了起泡性。然而，由于低分子质量肽不能在界面形成具有黏附性质的膜，因而过度的水解会损害起泡能力，当酶用量达到一定程度后，由于底物浓度不能对酶达到饱和，导致酶的作用受到抑制，酶用量的增加不能再提高起泡性。如图1所示，图一 加酶量对起泡性与泡沫稳定性的影响3.1.2 底物浓度采用2%，4%，6%，8%，10%的底物浓度，豌豆蛋白在酶浓度、酶解时间、酶解温度、pH 值不变的条件下，在较低底物浓度时，随着底物浓度增加，起泡性和起泡稳定性逐渐增大。这可能因为随着底物浓度的增加，使蛋白液表面的浓度提高，从而增加了亲水基团和疏水的非极性基团，增大了蛋白酶与底物蛋白分子肽键的接触机会，使得气泡易于形成，提高了蛋白质的起泡性。当底物浓度增加达到8%时，起泡性与泡沫稳定性达到最大值，随后当底物浓度继续增大时，起泡能力开始呈现下降趋势，这可能是因为底物浓度较大时，在不断受热的情况下，小分子进一步聚合形成可溶性的聚合多肽，界面张力增加，起泡性逐渐减小。如图二所示图二 底物浓度对起泡性与泡沫稳定性的影响3.1.3 酶解时间分别采用10分钟，20分钟，30分钟，40分钟，50分钟，60分钟的酶解时间试验，在酶浓度、底物浓度、酶解温度、pH 值不变的情况下，随着酶解时间的延长，起泡能力随之变大，当达到30分钟时，起泡能力与泡沫稳定性达到最大值，而后起泡能力逐渐减小，达到最弱。在酶解初期，由于豌豆蛋白质分子中的NH2、COOH 之间形成的氢键数目增多，形成的薄膜具有足够的黏性和机械强度，使得豌豆蛋白的起泡性增加。随着酶解过程的进行，NH2、COOH的数目不断增加，电荷数目也随之增加，当增加到一定程度后，气液薄膜强度降低，泡沫易破裂，起泡性也随之降低。如图三所示：图三 酶作用时间对起泡性与泡沫稳定性的影响3.1.4 温度影响分别采用30，40，50，60，70的酶作用温度进行试验，随着酶解温度的升高，起泡性和起泡稳定性逐渐增大，当温度达到50时，豌豆蛋白的起泡能力及起泡稳定性最好，随着温度的继续升高，起泡性又逐渐减小，这可能是因为酶都有自己的最适温度，超过这一温度，酶就会变性。如图所示图四 酶作用温度对起泡性与泡沫稳定性的影响3.1.5 pH影响分别采用pH5，pH6，pH7，pH8，pH9作为酶作用pH值进行试验，在pH逐步增加的时候，豌豆蛋白气泡能力与泡沫稳定性逐步增强，在pH8时，达到最大值，而后随着pH值的进一步增加，起泡能力与泡沫稳定性慢慢减弱，pH值主要是通过改变蛋白质功能基团的电离作用和双电层厚度来影响蛋白质与蛋白质的相互作用，最终来影响凝胶强度的变化。在近等电点处，蛋白质通常形成结块状凝胶；在极端pH值处，由于强烈的静电排斥作用，蛋白质则形成弱凝胶。如图五所示图五 PH对起泡性与泡沫稳定性的影响3.2 响应面实验设计与结果根据单因素的实验结果，起泡性随底物浓度的增加，变化趋势较缓，所以我们固定底物浓度为8%，考虑加酶量、时间、温度、pH值四个因素之间的相互作用对酶解反应的影响。本实验以起泡活性和起泡稳定性为响应值，设计四因素三水平共29个实验点的响应分析实验，在此基础上得出各因素之间的最佳组合。实验设计及结果见下列表格：表6 响应面实验设计与结果序号加酶量/%时间/minpH温度/FAIFSI10.1630950255.544.6820.230755262.054.3030.220855267.550.6940.1230755250.044.8050.240855261.556.8160.1630750254.554.3370.1630855325.569.1380.1640955262.549.6190.1640755246.546.22100.1640860264.051.13110.1630760261.048.81120.1620860275.058.90130.230860263.553.38140.1630855325.562.94150.1240855269.047.25160.1640850266.555.18170.1630855325.063.73180.122085526857.72190.163096026053.25200.123095526851.81210.162075526453.59220.230955247.543.63230.1230850262.552.80240.1630855325.563.96250.163085532963.22260.162095525146.81270.230850268.555.40280.162085026352.97290.1230860279.556.743.2.1 实验结果回归分析运用 Design Expert 6.0.5 软件对29个试验点的响应值进行回归分析，各因素的方差分析见表表7 起泡能力方差分析表SourceSum of SquaresDFMean SquareF ValueProbF显著性Model18451.19141317.941241.11 0.0001*A58.52158.5255.10 0.0001*B28.52128.5226.850.0001*C3.5213.523.310.0901*D88.02188.0282.88 0.0001*A25544.8515544.855221.61 0.0001*B25979.7715979.775631.17 0.0001*C210307.15110307.159706.28 0.0001*D25264.0215264.024957.15 0.0001*AB12.25112.2511.530.0043*AC264.061264.06248.66 0.0001*AD121.001121.00113.94 0.0001*BC210.251210.25197.99 0.0001*BD52.56152.5649.49F”F”F显著性Model1126.391480.4539.02 0.0001*A0.7910.790.380.5450B17.46117.468.460.0114C12.52112.526.070.0273D3.9213.921.900.1893A2220.671220.67107.03 0.0001*B2206.171206.17100.00 0.0001*C2651.161651.16315.83 0.0001*D2120.041120.0458.22 0.0001*AB68.87168.8733.40 0.0001*AC78.18178.1837.92F”F”F的值小于0.05时表明显著，ProbF越小则该变量对指标的影响越显著。因此从表7中可以看出，对于起泡性A,D,A2,B2,C2,D2，AC,AD,BC,BD的影响最为显著；从表8中可以看出，对于泡沫稳定性A2，B2，C2，D2，AB,AC的影响最为显著。失拟项的F值也都很小，表明该方程对试验拟合情况好，试验误差小，能够较好的描述各因素与响应值之间的真实关系，可以利用该回归方程确定最佳酶解工艺。3.2.2响应面实验优化分析与结果响应面分析方法的图形是响应值对各试验因子所构成的三维空间的曲面图，从响应面分析图上可以看出最佳参数及各参数之间的互相作用。当特征值均为正值时，为山谷形曲面，有极小值存在；当特征值均为负值时，为山丘形曲面，有极大值存在；当特征值有正有负时，为马鞍形曲面，无极值存在。二维平面上的等高线图，则可以直观的反映出各因素对响应值的影响，从试验所得的响应分析图上可以分析出它们之间的相互作用。根据回归方程作出不同因子的响应面分析图。因素影响起泡性的响应面：图6 时间和加酶量对起泡性的影响 图7 PH和加酶量对起泡性的影响图8 温度和加酶量对起泡性的影响 图9 PH和时间对起泡性的影响图10 温度和时间对起泡性的影响 图11 温度和PH对起泡性的影响因素影响泡沫稳定性的响应面：图12 时间和加酶量对稳定性的影响 图13 PH和加酶量对稳定性的影响图14 温度和加酶量对稳定性的影响 图15 PH和时间对稳定性的影响图16 温度和时间对稳定性的影响 图17 温度和PH对稳定性的影响4.结论1本研究采用单因素试验确定了碱性蛋白酶改性豌豆蛋白起泡性能的范围，即加酶量0.00%0.20%，时间1060min，底物浓度2%10%，pH值59，温度3070。2 通过响应面试验确定了碱性蛋白酶改性豌豆蛋白起泡性能的最佳水解条件为加酶量0.16%、时间30min、PH8.00、温度55、底物浓度8%。3 通过进行单因素及响应面实验，证明碱性蛋白酶对豌豆蛋白的起泡性和泡沫稳定性有显著提高作用；豌豆蛋白经改性后，起泡性和泡沫稳定性的改善扩大豌豆蛋白的应用。 致 谢时光荏苒，我已经不知不觉度过了四年大学生活，上善若水，厚德载物，本实验是在郭兴凤教授的指导下完成的，论文的选题，资料的收集，实验过程及论文的撰写、修改等都倾注了导师的极大心血。她严谨的治学态度、高效的工作方法、实事求是的工作作风，平易近人的性格深深地影响了我，使我在学术上、思想上获益匪浅，同时也给了我一笔巨大的精神财富，借此机会向郭兴凤教授表示衷心的感谢！ 在做实验过程中，得到了本实验室研究生胡婷婷的热心支持，还有同组实验同学刘亚丽，袁若男，张赛，刘弈的真心帮助，在此一并表示真挚的感谢！参 考 文 献1 Chavan.U.D, McKenzie D.B, Shahidi.F. Functional properties of protein isolates from beach peaJ.Food Chemistry.2001,74:177-1872肖连冬，周尚，林华.利用中性蛋白酶改性麦芽蛋白功能特性的研究J.食品工业科技.2009,30(3):105-1083Gaspar Ros, Francisco Rincon, Carmen Martinez. Influence of enzymatic treatment on the nutritional and functional properties of pea flourJ. Food Chemistry.1998,63:71-784张鸿雁，郑树生，王成，王北艳.S9碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白优化条件研究J.China Brewing.2010,220(7):50-535孙冰玉，石彦国.微波对醇法大豆浓缩蛋白起泡性的影响J.中国粮油学报.2007,22(3):55-586李玉珍，肖怀秋.蛋白酶酶解液水解度对起泡性和乳化性的影响J.粮油食品科技.2009,17(6):21-227 Liu.S, Elmer.C, Low.N.H, Nickerson.M.T. Effect of PH on the functional behaviour of pea protein isolate-gum Arabic complexesJ.Food Research International.2010,43(1):489-4958 Tao Zhang, Bo Jiang, Mu Wanmeng