原创论文 益生菌耐药性研究进展.doc

益生菌耐药性研究进展摘 要：益生菌对人类的营养和健康有着非常重要的意义，在食品、医药和饲料工业中都有广泛的应用。本文综述了若干益生菌耐药性的研究进展，对从事益生菌研究的科技工作者具有一定的参考价值。关键词：益生菌；作用机理；耐药性；研究进展The Research Progresses on Antimicrobial Susceptibility of ProbioticsAbstract: Probiotics take an important part in human nutrition and health. Also, it used widely in food, medicine and feed industry. This paper summarizes some research progresses on antimicrobial susceptibility of probiotics, which will be helpful to the researchers who engage in antimicrobial susceptibility of probiotics.Key words: probiotics; mechanism of action; resistance; research progress近年来，关于益生菌对促进人类健康的研究越来越多，我们对益生菌的了解也越来越透彻，有关益生菌耐药性的报道也时常见诸国内外各大主流科研学术期刊，但其研究还有待深入。为此，本人综述了益生菌耐药性的研究进展，以图揭开益生菌耐药性的神秘面纱。1 益生菌简介1.1 概念和种类根据有关研究人员的定义，认为益生菌是指一类通过添加到食品或药品中，能够起到调节肠道微生态平衡，从而对人或动物产生有利影响的微生物1。作为益生菌应具备以下条件：(1)安全，即无毒性和非致病性；(2)具有耐受肠道胆汁和胃酸的能力，可在消化道内定植；(3)对宿主有益，有抗菌作用；(4)生长条件不苛刻，产品中活菌浓度高，有好的感官特征2。目前，常用的益生菌种类有双岐杆菌，乳酸杆菌和一些链球菌。其中，双岐杆菌有青春双岐杆菌、短双岐杆菌等；乳酸杆菌有嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、胚芽乳杆菌、短乳杆菌、纤维二糖乳杆菌和乳酸乳杆菌。其他用作益生菌的链球菌有：粪链球菌、乳链球菌、嗜热唾液链球菌和乙酸乳酸双链球菌。此外，还有明串球菌属、足球菌属、丙酸杆菌属和芽孢杆菌属的菌种也可用作益生菌。通常，应用于人体的益生菌有双岐杆菌、乳酸杆菌、肠球菌、枯草杆菌、腊样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酵母菌等，尤以双岐杆菌、乳酸杆菌、肠球菌应用广泛，其研究也较多。1.2 功效益生菌的功效多种多样，不同的研究者的结论虽各有差异，但他们均认同益生菌的如下功效：（1）改善肠道功能，根据陈有容等的研究，与肠道微生物耐性降低有关的免疫系统功能失调会导致慢性肠炎疾病，而这可以通过益生菌得到改善。另外益生菌在肠内繁殖，产生大量乳酸和醋酸，促进肠蠕动，改善通便；抑制外袭菌，因而可消除肠道感染和腹泻3。（2）免疫功能，M.T. Hamilton-Miller等对一些益生菌进行的研究表明：有些益生菌能够影响人体免疫系统的应答能力，不同菌体的影响程度不同4。而T. Mattila等也通过实验发现了乳酸杆菌能够增强机体的免疫能力5。（3）营养、抗癌、调节血脂、抗高血压等功能6。2 益生菌耐药性的分子机制 与普通细菌的耐药性一样，益生菌耐药性的分子机制一般分为：益生菌本身的固有特性，即耐药性存在于益生菌自身的染色体上，具有典型的种属特异性；获得性耐药，由后天获得，来源于基因突变或获得新基因。2.1 固有耐药性有些细菌或益生菌由于具有一些独特的结构或代谢，天生对某些药物不敏感。如芽孢杆菌，枯草杆菌等为革兰氏阴性菌，由于其有不同的细胞壁结构，对抗革兰氏阳性类抗菌药物天然不敏感，常见革染氏阴性杆菌对氨苄青霉素耐药率为100。嗜麦芽寡养单孢菌对亚胺培南和氨曲南耐药率为100，究其原因为嗜麦芽寡养单孢菌产生L1及L2型B一内酰胺酶，两者均为可诱导酶，前者属于金属B一内酰胺酶，后者属于丝氨酸活性酶，L1型酶是导致该菌对碳青烯类药物亚胺培南天然耐药的主要原因7。在某些乳杆菌、肠球菌等革兰氏阴性益生菌中由于细胞膜的通透性改变致使药物进入细胞内减少，就使得微生物细胞表现出抗药性。虽然大多数情况下，外膜孔蛋白缺失不是主要的耐药机制，但它可降低益生菌对抗生素的敏感性，在其它的耐药机制存在的情况下，可明显提高耐药程度。2.2 获得耐药性2.2.1 益生菌基因突变与药物选择一些益生菌耐药性的产生不是由于益生菌与药物接触而产生，而是自发突变加上药物长期选择的结果7。通常认为，抗药益生菌所含的抗菌基因是由敏感菌的遗传物质自发突变产生的，但一般自发突变的频率极低。极少量的抗药益生菌存在于大量的敏感菌之中原本不足为害，但经临床频繁使用抗生素之后，药物杀死或抑制敏感菌的生长，而抗药性细菌继续生长繁殖，无形中对抗药益生菌起了选择作用，造成抗菌株的大量增殖，形成抗药益生菌系。抗生素的广泛使用导致耐药菌株不断被筛选出来，并广泛传播。传统上认为突变发生于菌染色体DNA，但突变也可发生于质粒或转座子上的DNA。除结构基因突变外某些调节基因的突变也可导致细菌产生耐药性。如益生菌耐氟喹诺酮的主要机制主要是通过改变DNA解旋酶和或拓朴酶IV来改变靶位，或降低药物渗透力和提高外排系统活性，以减少细胞间药物蓄积。氟喹诺酮耐药的进化源于染色体内基因自发突变的累积，是一个逐步发展的过程8。靶基因的突变如果称不上是普遍的至少是常见的，靶基因突变只引起对氟喹诺酮类的特异性耐药，而菌外排泵活性或渗透性的改变则不仅能导致对喹诺酮的耐药，还对其他抗菌药物耐药，如-内酰胺类药、四环素和氯霉素等9。对氟喹诺酮较敏感的菌株至少在gyrA的Ser83位置上有一个突变点，并且对第一代喹诺酮如萘啶酸耐药，在这个研究中的耐药菌株都同时有gyrA和parC变异10。2.2.2 菌体间耐药基因的相互转移益生菌的菌耐药基因来源可以说比较复杂，其不仅可以由染色体携带，还常由染色体外的质粒11、转座子或整合子12携带，通过融合、转导和转化在不同种属的遗传物质之间转移或集聚重排造成多重耐药菌发生率大幅上升13。外源性相关的DNA小片段组合为内源性基因，它们几乎都通过自然转化和重组形成。对于自然转移的耐药质粒通过接合传播似乎是最常见的方式14。益生菌中带有耐药性基因的质粒可自行复制，代代相传，并在不同种属问(特别是肠道菌如肠球菌)进行转移，而导致抗药性的广泛传播。近年来，国内外学者采用先进的分子生物学技术对细菌和益生菌的耐药机制及快速检测方法进行了卓有成效的研究，并已取得了突破性进展15，但由于益生菌耐药性机理是个十分复杂的问题，还存在着许多问题，有待我们进一步解决。3 益生菌耐药性研究3.1 乳杆菌耐药性近年来，相对其它益生菌而言，对乳杆菌的抗生素敏感性进行的研究比校深入。有少部分研究者认为乳杆菌具有耐药性是有利的，当人们利用抗生素治疗疾病的时候不会将对人体有益的乳杆菌也一同杀灭。但是，有些乳杆菌有可能是潜在的致病菌，一旦成为致病原，由于它们具有耐药性将无法利用抗生素对其进行治疗。而且更重要的是，有些乳杆菌的耐药性具有可转移性，可能会转移到其它乳酸菌或致病菌中，对人类产生威胁16。据报道目前至少有25种乳杆菌具有固有的质粒，而且有的一种菌株里面有多个质粒17，例如，具有广谱宿主接合性的耐药性质粒pAMI31和piP501能够进行种间接合。研究者还对从风干的香肠中分离出来的一些乳杆菌进行了检测，发现它们具有一些大小约为10 KB左右的质粒(少数大于25 KB)，在这些质粒上携带了四环素耐药基因tet(M)18。此外，从植物乳杆菌5057株中还分离出来了携带四环素耐药基因的质粒pMD5057，该质粒已经完成了测序，结果发现其中的四环素耐药基因tet(M)与产气荚膜梭菌和金黄色葡萄球菌中tet(M)的序列高度同源。近来在红霉素耐药的发酵乳杆菌中还发现一个19.3KB的质粒，携带一种新的红霉素耐药性决定基因erm(LF)。罗伊乳杆菌发酵乳杆菌，嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌的中存在R质粒，它携带红霉素、氯霉素和大环内酯类林克霉素链阳性菌素的耐药基因19。同时，根据文献报道，乳杆菌对万古霉素、卡拉霉素、庆大霉素、链霉素、甲硝锉、氟哌酸、头孢噻、环丙沙星、利福平等药物具有固有耐药性20。3.2 双歧杆菌耐药性不同类型的抗生素对双歧杆菌的敏感性相差很大，-内酰胺类、四环类、氯霉素类、大环内脂类和利福平对该菌株较为敏感，而氨基糖苷类和黄胺类则不敏感20。这可能是由于双歧杆菌的细胞壁含有较多肽聚糖，使得有些抗生素不易通过。也有人认为是由于双歧杆菌可分泌与糖代谢有关的酶，这些酶可分解氨基糖苷类抗生素，从而使其具有抗药性，而双歧杆菌中质粒的存在也会对其耐药性产生较大影响21。据张燕燕等人通过对双歧杆菌标准菌株和从酸奶中分离的4株双歧杆菌菌株进行环丙沙星的耐药性试验，从中筛选出耐药菌株，再用质子泵抑制剂2，4-二硝基酚结合荧光分光光度法检测了耐药菌株和标准菌株对环丙沙星的摄取情况，通过对比2，4-二硝基酚存在与否菌体对环丙沙星的摄取量变化，从而确证了双歧杆菌外排系统的存在，其实验表明双歧杆菌有外排系统作用介导的对环丙沙星耐药的机制22。同样的，双歧杆菌对万古霉素、卡拉霉素、庆大霉素、链霉素、甲硝锉、氟哌酸、多粘菌素等药物具固有耐药性23。总的来说，双歧杆菌存在广泛的耐药性，实验室目前分离的双歧杆菌几乎都存在不同程度的耐药性。3.3 肠球菌耐药性肠球菌种类多，但由于抗生素大量滥用，如今的肠球菌相比其它益生菌而言，更易具耐药性。目前许多乳酸菌属都对万古霉素具有耐药性，而我们知道万古霉素是其它抗生素失效后的最后一道防线24，但值得重视的是，某些肠球菌所具有的万古霉素耐药性还可以转移给其他菌属。肠球菌属也是一种较易发生接合性转移的菌属，它是一种常用的接合受体菌，但同时它也可以作为供体菌向非亲缘关系的肠球菌，乳酸杆菌和其他革兰阳性菌例如芽胞杆菌，葡萄球菌和李斯特菌，甚至是革兰阴性菌转移耐药基因25。研究发现参与接合性转移的DNA元件包括携带卡那霉素耐药基因的质粒和携带四环素与红霉素耐药基因的转座子26。近年来，国内已有许多研究者对肠球菌的耐药性进行了研究，糜祖煌研究认为，肠球菌的B内酰胺类耐药多数与葡萄球菌一样，是因为产B内酰胺酶所致；而肠球菌对低浓度和中浓度的氨基糖苷类药物表现为天然耐药；肠球菌对大环内酯类、林可霉素类、链阳菌素B类抗菌药物有着相同的抗菌机制和耐药机制，即通过产生红霉素甲基化酶27。此外，国内许多研究者通过分子生物学的方法对肠球菌的耐药基因进行了检测，成果显著。3.4 其它益生菌耐药性由于前面几种益生菌较常见，应用也较广泛，因此人们对它们的研究也较多，而其它的益生菌却问津者寡，仅有零星报导。据宋战昀等人的研究认为，枯草杆菌细胞膜上存在Bmr等主动外排系统，编码Bmr蛋白的基因bmr在染色体上的扩增或者在质粒内的过度表达都会导致枯草杆菌表现多重耐药，包括溴化乙锭、罗丹明6G、四环素、丫啶橙、氯霉素、诺氟沙星等氟喹诺酮类药物28。张培德等人用亚硝基胍对球形芽孢杆菌进行化学诱变，筛选到利福平和链霉素二个标记菌株，抗药浓度均达100 uml枷培养基，且其抗药性状能够获得较好地遗传29。丙酸杆菌、益生链球菌、酵母菌等也有其耐药性的少量报导，但本人认为其研究才刚刚起步。4 结语 益生菌与其他细菌一样为了在抗生素条件下生存就会发生基因突变、转移、重组等耐药现象，因此我们一方面要避免抗生素的滥用，另一方面也要避免使用具有可转移性耐药性的益生菌，同时，我们也要避免具有可转移耐药性的细菌从动物来源进入食物而引起体内的益生菌产生耐药性。总之，无论出于何种原因，作为益生菌都不应该具有耐药性。伴随着蓬勃发展的分子生物学技术，今后的研究将会彻底阐明益生菌的耐药机理，从而开发出新型益生菌，为人类健康服务。参考文献：1 Fuller R. Probiotics in man and animalsJ. J Appl Bact, 1989, 66: 365378.2 顾文杰, 彭科峰, 张晓东等. 益生菌的功效及遗传修饰. 生物信息学，2006，4: 186-189.3 陈有容, 郑小平. 益生菌的健康功效及其应用J. 上海水产大学学报，2001，10(3): 2692754 M.T. Hamilton-Miller, S.Shah. Deficiencies in microbioiogical quality and labeling of probiotic supplements. International Journal of Food Microbiology. 2002, 27(1-2): l-75.5 T. Mattila, Sandholm, P. Myllarinen, R. Crittenden, et al. Technological challenges for future probiotic foods, International Dairy Journa1. 2002, 12(2-3): 173-182.6 Taksno T. Milk derived peptides and hypertension reductionJ. Infl DairyJ, 1998, 8: 375-381.7 邓小红.微生物耐药性的分子机制研究进展. 药学进展, 2008，18（4）：3-6.8 Lzumi S, Aranishi F. Relationship between gyrA mutations and quinolone resistance in Flavobacterium psychrophilum isolates. Appl Environ Microbiol, 2004, 70(7): 3968-3972.9 Macinga DR, Renick PJ, Makin KM, et al. Unique biological properties and molecular mechanism of 5, 6-bridged quinolones. Antimicrob Agents Chemother, 2003, 47(8): 2526-2537.10 Tran JH, Jacoby GA. Mechanism of plasmid-mediated quinolone resistance. Proc Natl Acid Sci USA, 2002, 99(8): 5638-5642.11 Davies J, Smith D1. Plasmid-determined resistance to antimicrobial agentsJ. Annd Rev Microbiol, 1978, 32: 469-518.12 Dorthe S, Frank MA, Lars BJ. Charactefisation of integrons and an tibiotic resistance genes in Dan ish multiresistants Salmonella enterica Typhirnuriurn DT104J. FEMS Microbiology Letter 1998, 160: 37-41.13 Mobak KDL, Baggesen FK, Aarestrup JM, et a1. An outbreak of multidrug-resistant, quinolone-resistant Salmonella enterica sero type Typhimuriurn DT104N. Ensl Med, 1999, 341: 1420-1425.14 Corpet DE, Lumeau S, Corpet F. Mimimum antibiotic levels for selecting a resistance plasmid in a gnotobiotec animal modelJ. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1989, 33(4): 535-540.15 崔晓文, 张秀英. 细菌耐药性产生的分子机制与耐药基因的快速检测方法. 中国兽药杂志, 2004, 38(9): 30-32.16 ZHOU JS, et al. Antibiotic susceptibility profiles of new probiotic Lactobacillus and Bifiddobacterium strains. Int J Food Microbiol, 2005, 98(2): 211-217.17 WANG TT, LEE BH. Plasmids in Lactobacillus. Crit Rev Biotechnol, 1997, 17(3): 227-272.18 GEVERS D, et al. Molecular characterization of tet(M) genes in Lactobacillus isolates from different types of fermented dry sausage. Appl Environ Microbiol, 2003, 69(2): 1270-1275.19 GFELLER KF. Molecular analysis of antimicrobial resistance determinants of commensal lactobacillus. PhD thesis, Swiss Federal Institute of Technology Zurich, Switzerland, 2003.20 TEUBER M, MEILE L, SCHWARZ F. Acquired antibiotic resistance in lactic acid bacteria from food. Anto