实验四离子交换层析分离单核苷酸.ppt

实验四 离子交换层析 分离单核苷酸 目的要求目的要求 通过以强碱性离子交换树脂分离单核苷酸，通过以强碱性离子交换树脂分离单核苷酸， 学习和掌握离子交换层析的原理和操作方法。学习和掌握离子交换层析的原理和操作方法。 离子交换层析（离子交换层析（Ion Exchange ChromatographyIon Exchange Chromatography简简 称为称为IECIEC）是以离子交换剂为固定相，特定的离子溶）是以离子交换剂为固定相，特定的离子溶 液为流动相，依据各种离子或离子化合物与离子交液为流动相，依据各种离子或离子化合物与离子交 换剂的换剂的结合力不同结合力不同进行分离纯化的层析方式进行分离纯化的层析方式。 离子交换层析的基本原理 树脂树脂 N+(CHN+(CH 3 3 ) ) OH-OH- 离子交换层析的基本原理 离子交换剂由基质基质、电荷基团电荷基团（或称功能基团 ） 和 反离子反离子组成。基质一般是不溶性聚合物，如 树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等；等； 纤维素纤维素O O CH CH 2 2 COO COO - - Na Na 基质 电荷基团 反离子 n n RA+BRA+B RB RBA A + + (RA(RA是阳离子交换剂是阳离子交换剂 ，B B为溶液中的离子或待分离的生物分子）为溶液中的离子或待分离的生物分子） 离子交换层析的基本原理 当当A+=B+,RBRA, A+=B+,RBRA, 说明说明 R R 与与B B的结的结 合力比合力比A A大；反之亦然。大；反之亦然。 对于两性蛋白而言，结合力取决于其对于两性蛋白而言，结合力取决于其等电点以及等电点以及 溶液的溶液的pHpH值值。 n n 平衡装柱平衡装柱 离子交换剂带上反离子离子交换剂带上反离子(R-O-X(R-O-X + +) ) n n 上样上样 样品（样品（A A , , B+ B+ ，C C + + ，等）与反离子（，等）与反离子（X X ）竞争与电荷基 ）竞争与电荷基 团结合；（结合力团结合；（结合力A A B+ B+Y Y + + C C + + X X ） ） n n 洗脱洗脱 洗脱液中的离子成分（洗脱液中的离子成分（Y Y ）与样品 ）与样品(A(A 等）竞争结合电 等）竞争结合电 荷基团，首先荷基团，首先C C洗下来，随着洗下来，随着Y Y浓度增加，浓度增加，B B洗脱出洗脱出 ，最后，最后A A出来，使样品分离。出来，使样品分离。 所以从上样到洗脱都是根据结合力的大小进行进行的所以从上样到洗脱都是根据结合力的大小进行进行的 。洗脱液的选择很重要，要使有效成分和杂质分离。洗脱液的选择很重要，要使有效成分和杂质分离。 离子交换层析的基本步骤 离子交换层析的基本步骤离子交换层析的基本步骤 n n 1. 1. 单核苷酸的结构单核苷酸的结构 碱水解使核酸降解为碱水解使核酸降解为22或或33单核苷酸混合物，在单核苷酸混合物，在22 ，或，或33位带磷酸基团。位带磷酸基团。 离子交换层析分离单核苷酸的原理离子交换层析分离单核苷酸的原理 2. 2. 阴离子交换层析分离单核苷酸的依据阴离子交换层析分离单核苷酸的依据 单核苷酸为两性电解质，几种单核苷酸的等电点单核苷酸为两性电解质，几种单核苷酸的等电点 AMP 2.65AMP 2.65 GMP 2.35 GMP 2.35 CMP 4.5 CMP 4.5 UMP 1.55 UMP 1.55 按等电点由高到低：按等电点由高到低：CMPAMPGMPUMPCMPAMPGMPUMP 但是由于树脂对嘌呤的吸附力大于对嘧啶的吸附，所以洗脱但是由于树脂对嘌呤的吸附力大于对嘧啶的吸附，所以洗脱 顺序是顺序是 ：CMP-AMP-UMP-GMPCMP-AMP-UMP-GMP 如果以阴离子交换剂分离，洗脱顺序是：如果以阴离子交换剂分离，洗脱顺序是： CMPAMPGMPUMPMPAMPGMPUMP 离子交换层析分离单核苷酸的原理离子交换层析分离单核苷酸的原理 3. 23. 2，33单核苷酸等电点的差异单核苷酸等电点的差异 由于 由于22和和33核苷酸的磷酸基团与碱环的距离不同，所以核苷酸的磷酸基团与碱环的距离不同，所以 碱环上碱基基团的碱环上碱基基团的pKpK值有区别，所以值有区别，所以22和和33核苷酸的核苷酸的PIPI 值有区别。值有区别。22核苷酸的核苷酸的PIPI值略高于值略高于33核苷酸的等电点。核苷酸的等电点。 所以每种单核苷酸洗脱时出现所以每种单核苷酸洗脱时出现2 2个峰。个峰。 离子交换层析分离单核苷酸的原理离子交换层析分离单核苷酸的原理 n4. 离子交换剂的类型离子交换剂的类型 所用的离子交换剂为阴离子交换树脂，所带电荷基团所用的离子交换剂为阴离子交换树脂，所带电荷基团 为季铵基。为季铵基。 树脂树脂 N N + + (CH(CH 3 3) )3 3 离子交换层析分离单核苷酸的原理离子交换层析分离单核苷酸的原理 离子交换层析分离单核苷酸的实验步骤离子交换层析分离单核苷酸的实验步骤 n n 1 1）样品的获得）样品的获得 以以KOH 37KOH 37CC水解酵母 水解酵母RNARNA，生成，生成22或或33核苷酸混合核苷酸混合 物。最终物。最终pHpH值调到值调到8.08.0（注意核苷酸所带电荷！注意核苷酸所带电荷！）。具体操）。具体操 作见讲义作见讲义p23p23。 n n 2)2)交换剂的平衡和装柱交换剂的平衡和装柱 以以甲酸钠甲酸钠溶液平衡，反离子为甲基（溶液平衡，反离子为甲基（COO- COO-）。具体步骤见）。具体步骤见 讲义讲义p23p23。 3 3）加样）加样 以滴管加入以滴管加入1.0ml1.0ml样品，以样品，以3 34d/min4d/min 的速度让其进入层 的速度让其进入层 析柱。然后以析柱。然后以200ml ddH200ml ddH 2 2 O O洗柱至洗柱至ODOD260 2600.02 0.02。 离子交换层析分离单核苷酸的实验步骤离子交换层析分离单核苷酸的实验步骤 4 4）洗脱并检测）洗脱并检测 依次用以下溶液分段洗脱：依次用以下溶液分段洗脱：250ml250ml 0.02mol/L0.02mol/L甲酸；甲酸； 250ml250ml 0.15mol/L0.15mol/L甲酸；甲酸； 250ml 250ml 0.01mol/L0.01mol/L甲酸甲酸 0.05mol/L0.05mol/L甲酸钠溶液（甲酸钠溶液（pH4.44pH4.44); 250ml ); 250ml 0. 1mol/L0. 1mol/L甲酸甲酸 0.1mol/L0.1mol/L甲酸钠溶液（甲酸钠溶液（pH3.74);pH3.74);流速流速1ml/min1ml/min。 收集洗脱液，收集洗脱液，10ml10ml一管分别进行紫外检测，并记录吸一管分别进行紫外检测，并记录吸 收值。收值。 离子交换层析分离单核苷酸的实验步骤离子交换层析分离单核苷酸的实验步骤 5) 5) 分析检测分析检测 a. a. 根据记录的紫外吸收值，分别做出分步洗根据记录的紫外吸收值，分别做出分步洗 脱曲线脱曲线( (如图所示）。如图所示）。 离子交换层析分离单核苷酸的实验步骤离子交换层析分离单核苷酸的实验步骤 b. b. 保留各组